연재 순서

   1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis

이번 연재에서는 Next Generation Sequencing의 두 번째 Application인 Expression study 중에 유전자와 엑손의 발현 및 발현된 유전자의 각종 변이 등을 한 번에 연구할 수 있는 RNA-Seq 분석에 대해 알아보겠습니다.

2-2-6. RNA-Seq Analysis


 Serial Analysis of gene Expression(SAGE), Cap Analysis of gene expression (CAGE), 그리고 Massively Parallel Signature sequencing(MPSS)은 특정 유전자의 발현 양 정보를 얻고자 하는 목표로 수행되는 방법들이다. 이러한 방법들은 많이 이용되고 있지만 Sanger 방법에 바탕을 둔 것으로 높은 비용과 짧은 reads는 reference 서열에 유일하게 매핑하기 힘들다는 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제점들을 극복하기 위한 방법으로는 유전자와 엑손의 발현 및 발현된 유전자의 각종 변이 등을 한 번에 연구할 수 있는 RNA-Seq기술이 있다[1].

표 1에서 보는 것과 같이 RNA-Seq을 분석 할 수 있는 프로그램에는 여러 가지 소프트웨어가 있는데 그 중에 CLC Genomics Workbench는 annotation된 Reference 유전체 서열과 mRNA 시퀀싱 reads를 바탕으로 새로운 엑손의 발굴뿐만 아니라 유전자 발현 레벨을 계산할 수 있다. RNA-Seq 분석은 몇 가지 단계로 수행된다. 먼저, Reference 서열에서 모든 유전자를 추출한다. 이 때 유전자 서열의 다른 annotation들은 보존된다[23].

사용자 삽입 이미지
다음으로 영역 주변의 엑손-엑손 경계를 추출한다. 그 다음으로 모든 엑손-엑손 junctions plus에 대한 Reference assembly가 수행된다. 이 assembly로부터 각각의 유전자에 대해 발현 수치가 계산되고 putative exon을 확인할 수 있다. 발현 수치는 RPKM(reads per kilobase of exon model per milion mapped reads)방법으로 측정된다(그림 9).

사용자 삽입 이미지
그림 9. RNA_seq analysis.
(a) exon-exon junction+gene 서열을 reference 서열로 한다.
(b) NGS reads의 reference assembly를 통한 alignment를 통해
새로운 각 엑손 단위 혹은 유전자 단위의 발현양을 확인한다.


다음 연재에서는 한정적인 유전자를 좀 더 다양하게 활용할 수 있는 Alternative splicing 분석에 대해 알아보겠습니다. 많은 관심 부탁드립니다.


참고문헌


1. Mortazavi A, Williams BA, McCue K, Schaeffer L, Wold B. (2008) Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 7, 621-628.
2. Fei Z, Tang X, Alba RM, White JA, Ronning CM, Martin GB, Tanksley SD, Giovannoni JJ. (2004) Comprehensive EST analysis of tomato and comparative genomics of fruit ripening. Plant J. 40, 47–59
3. Rensink WA, Lee Y, Liu J, Iobst S, Ouyang S, Buell CR. (2005) Comparative analyses of six solanaceous transcriptomes reveal a high degree of sequence conservation and species-specific transcripts. BMC Genomics. 6, 124
4. Ronning,C.M. et al. (2003) Comparative analyses of potato expressed sequence tag libraries. Plant Physiol. 131, 419–429
5. Guo J, Zhu P, Wu C, Yu L, Zhao S, Gu X. (2003) In silico analysis indicates a similar gene expression pattern between human brain and testis. Cytogenet Genome Res. 103, 58-62
6. Benjamini, Y., Daniel Yekutieli. (2001) The control of the false discovery rate in multiple hypotheses testing under dependency. Annal. Stat. 4(29), 1165–1188
7. Tsai CA, Hsueh HM, Chen JJ. (2003) Estimation of false discovery rates in multiple testing: application to gene microarray data. Biometrics. 59, 1071-81
8. Audic S, Claverie JM. (1997) The significance of digital gene expression profiles. Genome Res. 7, 986–995
9. Roche 454 : Products & Solutions - Multiplexing
(http://www.454.com/products-solutions/experimental-design-options/multiplexing.asp)
10. Tatusov RL, Koonin EV, Lipman DJ. (1997) A genomic perspective on protein families. Science. 278, 631-637
11. Kato T, Murata Y, Miura K, Asai K, Horton PB, Koji T, Fujibuchi W. (2006) Network-based de-noising improves prediction from microarray data, BMC Bioinformatics. 7, S4
12. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 5, 229-243
13. Zeeberg BR, Feng W, Wang G, Wang MD, Fojo AT, Sunshine M, Narasimhan S, Kane DW, Reinhold WC, Lababidi S, Bussey KJ, Riss J, Barrett JC, Weinstein JN. (2003) GoMiner: a resource for biological interpretation of genomic and proteomic data, Genome Biol. 4, R28
14. GeneSpring GX : Products & Services - GeneSpring GX Software
(http://www.chem.agilent.com/en-US/products/software/lifesciencesinformatics/genespringgx/pages/default.aspx)
15. Wingender E, Chen X, Hehl R, Karas H, Liebich I, Matys V, Meinhardt T, Prüss M, Reuter I, Schacherer F. (2000) TRANSFAC: an integrated system for gene expression regulation. Nucleic Acids Research. 28, 316-319
16. PathwayStudio : Products-pathway Studio
(http://www.ariadnegenomics.com/products/pathwaystudio/)
17. Eveland AL, McCarty DR, Koch KE. (2007) Transcript profiling by 3'-untranslated region sequencing resolves expression of gene families. Plant Physiol. 146, 32-44.
18. Torres TT, Metta M, Ottenwälder B, Schlötterer C. (2008) Gene expression profiling by massively parallel sequencing. Genome Res. 1, 172-7.
19. Vega-Arreguín JC, Ibarra-Laclette E, Jiménez-Moraila B, Martínez O, Vielle-Calzada JP, Herrera-Estrella L, Herrera-Estrella A. (2009) Deep sampling of the Palomero maize transcriptome by a high throughput strategy of pyrosequencing. BMC Genomics. 10, 299.
20. Wang ET, Sandberg R, Luo S, Khrebtukova I, Zhang L, Mayr C, Kingsmore SF, Schroth GP, Burge CB. (2008) Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 2456, 70-76.
21. Johnson JM, Castle J, Garrett-Engele P, Kan Z, Loerch PM, Armour CD, Santos R, Schadt EE, Stoughton R, Shoemaker DD. (2003) Genome-wide survey of human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays. Science. 302, 2141-2144.
22. Ledford H. (2008) Human genes are multitaskers. Nature. 456, 9.
23. CLC Genomics Workbench: RNA-Seq analysis
(http://www.clcbio.com/index.php?id=1330&manual=RNA_Seq_analysis.html)

Posted by 人Co

2010/03/04 08:59 2010/03/04 08:59
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이번 연재에서는 Next Generation Sequencing의 첫 번째 Application인 Variation study 중에  Targeted Sequencing (Sequence Capture) 기술에 대해 알아보도록 하겠습니다.

2-1-3. Targeted Sequencing (Sequence Capture)


 최근 염기서열 분석은 전체 유전체의 염기서열 분석에만 치중하지 않고, 관심이 있는 특정 유전체의 일부분을 분석하고자 하는 경향이 대두되고 있다. 또한 NGS가 출현하면서 염기서열 분석의 작업량이 증가하자 PCR을 이용한 타겟 시퀀싱에서 병목현상을 일으키기 시작하였다. 이러한 문제를 해결하기 위해 ‘Sequence Capture’라는 기술이 개발되었고 Roche NimbleGen에서 처음 상용화 되어 관심 있는 특정 유전체의 일부분을 선택적으로 분석을 할 수 있어 NGS를 이용한 유전체 분석에서 중요한 부분을 차지하게 이르렀다.

Sequence Capture 기술은 타겟으로 하는 유전체의 각 부위와 상보적으로 결합하도록 디자인된 프로브가 올려져있는 DNA chip과 분석하고자 하는 샘플의 유전체 서열간의 hybridization을 진행하여 특이적으로 결합한 DNA 절편들을 분리 후 NGS를 이용하여 직접적으로 시퀀싱을 진행하는 방식이다(그림 5).

사용자 삽입 이미지
그림 5. Sequence Capture 원리.
Genome 서열을 무작위 적으로 절단하여 엑손 영역만이 프로브로 심겨진 DNA chip에 hybridization한다. 이 후 DNA chip의 프로브 서열과 결합된 유전체의 엑손 서열을 chip에서 분리하여 NGS 방식의 시퀀싱으로 서열을 결정한다.

NGS로 염기서열을 분석하기 때문에 타겟 서열의 coverage가 굉장히 많이 향상되어 원하는 부분의 정확한 서열 정보를 얻을 수 있다. 이러한 Sequence Capture 방법을 이용하여 워싱턴주립대학과 Agilent사의 연구팀이 공동으로 Target Capture Array로부터 Illumina GA를 사용하여 8명의 HapMap Individual과 4명의 희귀질환인 Freeman-Sheldon syndrome (FSS)을 가진 환자의 엑손 영역만을 시퀀싱하여 protein coding variation을 찾은 연구를 수행하였다[8].

그 결과 Freeman-Sheldon syndrome(FSS)의 원인 유전자로 알려진 MYHS 유전자만이 정상인과 환자 사이에서 차이를 보인다는 것을 확인하였다[7]. Human의 전체 유전체는 30억 염기쌍이지만 그 중 유전자 영역인 엑손은 전체 염기의 약 1%에 해당하는 3천만 염기쌍 정도 이다. NGS 기술로 인해 유전체 시퀀싱이 쉽고 빠르게 되었다고는 하지만, 아직 높은 비용이기 때문에 이러한 엑손 시퀀싱으로 유전체 전체를 대상으로 보고자 하는 영역만을 보다 빠르고 저렴하게 분석할 수 있다는 것이 매우 고무적이라 하겠다.

다음 연재에서는 variation의 마지막 다양하게 구축되어 운영되고 있는 SNP 및 variation 데이터베이스에 대해 알아보도록 하겠습니다.
많은 관심 부탁드립니다.

참고문헌

 1. 이종극 (2006) 질병유전체분석법(Genetic Variation and Diseases)
 2. Eck SH, Benet-Pagès A, Flisikowski K, Meitinger T, Fries R, Strom TM. (2009) Whole genome sequencing of a single Bos taurus animal for single nucleotide polymorphism discovery. Genome Biol. 10(8), R82.
 3. Ganal MW, Altmann T, Röder MS. (2009) SNP identification in crop plants. Curr Opin Plant Biol. 2, 211-217
 4. Xie C, Tammi MT. (2009) CNV-seq, a new method to detect copy number variation using high-throughput sequencing. BMC Bioinformatics. 10, 80
 5. Illumina : SNP Genotyping and CNV Analysis
  (http://www.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_genomic_sequence.pdf)
 6. Bentley DR. et al. (2008) Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 2008 456, 53-59
 7. Ng SB. et al. (2009) Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461, 272-276
 8. Koboldt DC, Miller RD, Kwok PY. (2006) Distribution of human SNPs and its effect on high-throughput genotyping. Hum Mutat. 3, 249-254.
 9. 박종화 (2009) 변이체학을 위한 생정보학 분석도구. Medical POSTGRADUATES. 3(37), 131-133
 10. 유향숙, 김선영 (2009) Variome 국제연구동향. Medical POSTGRADUATES. 3(37), 134-137
 11. 임선희, 정연준. (2009) 새로운 유전체 변이의 등장 : 유전자 복제수 변이. Medical POSTGRADUATES. 3(37), 149-153












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2010/02/19 10:13 2010/02/19 10:13
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