연재 순서

   1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis

이번 연재에서는 NGS Application의 마지막 내용으로 Next Generation Sequencing 데이터를 분석하고 처리하기 위해서 이에 적합한 새로운 형태의 생물정보학인 'Next Generation Bioinformatics'에 대해 알아보겠습니다.


3-1. Next Generation Bioinformatics

 
 Applied Biosystems, Illumina 그리고 Roche 등과 같은 분석장비 개발회사에서 출시한 Next Generation Sequencers의 출현으로 전통적인 유전체 데이터 분석법에 새로운 변화와 도전이 요구되고 있다. 이러한 Sequencer들은 전에는 생각할 수 없었던 많은 양의 시퀀스 데이터를 쏟아내고 있고 이것은 생물정보학과 전산 생물학에 다양한 변화와 혁신을 초래하였다.

 Next Generation Sequencing 데이터를 분석하고 처리하기 위해서 이에 적합한 새로운 형태의 생물정보학, 즉 ‘Next Generation Bioinformatics’에 대한 준비를 해야 할 것이다. NGS 데이터를 다룰 수 있는 충분한 저장장치, 관리 솔루션 그리고 생물정보학 분석 파이프라인 구축이 성공적인 NGS 연구에 필수적인 요소이다.

 현재 대다수의 생물정보학 전문가들은 생물학자들이 다루기 힘든 커맨드 라인 방식의 데이터 처리로 실험 연구자들과의 분석 결과 검토를 위한 자료를 따로 작성하고 있다. 이는 생물학 데이터가 NGS의 도입에 의해 폭발적으로 증가된 상황에서는 매우 소모적인 것으로 실험 연구자들이 쉽게 분석결과를 검토하고 판별할 수 있는 플랫폼 개발이 요구되며, 직관적이거나 그래픽 사용자 인터페이스에 대한 요구를 좀 더 다양하게 충족시켜야 함을 나타낸다. 뿐만 아니라 대부분의 초기 분석이 리눅스와 같은 유닉스 환경에서 이뤄지고 있고, 생물학적 의미론을 분석하는 단계에서는 대부분 실험 연구자들이 이용하는 윈도우 환경에서 이뤄지므로 이들 간의 유기적인 데이터 교류를 위한 포맷 변화도 필요한 실정이다. 따라서 운영체제에 상관없이 NGS 데이터를 분석할 수 있으며, 서로 다른 운영체제에서도 데이터를 자유롭게 입출력을 할 수 있는 시스템 마련이 필요하다. 또한 공동 연구 및 컨소시엄을 통한 분석 방법이 늘어나는 추세이므로, 분석 데이터를 공동으로 관리할 수 있는 데이터베이스의 구성, 분석 프로그램의 표준화 및 정규화 그리고 많은 프로그램들을 연계한 효율적인 데이터 분석 파이프라인 구축 또한 요구된다.

앞으로 NGS 데이터는 임상 진단과 개인 맞춤 의약 연구에 직접적으로 이용되어질 전망이다. 이에 앞서 언급된 차세대 생물정보학에 대한 다양한 요구들이 쏟아질 것이다. 이러한 문제들이 해결되지 않는다면 조만간 생물정보학이 생물학 관련 연구에 큰 걸림돌이 될 수 있을 것이다[1].
 

다음 연재에서는 웹 2.0 시대에 맞추어 다양한 분야에서 생산된 데이터를 효율적으로 관리하는 방법에 대해 알아보겠습니다.  많은 관심 부탁드립니다.



참고문헌

1. Kwok-Wing Stephen Tsui (2009) Next Generation DNA Sequencing and Bioinformatics: Bottlenecks and Opportunities. The Third International Symposium on Optimization and Systems Biology

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2010/03/29 17:30 2010/03/29 17:30
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   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis


이번 연재는 Genome Annotation의 마지막 내용으로 수학적 알고리즘에 의한 유전자 예측으로 생각할 수 없었던 예외적인 부분을 실제 유전자의 구조를 하나씩 살펴가며 수정 작업을 거치는 Professional Curation에 대해 알아보겠습니다.


2-4-3. Professional Curation


 A. 상동성 기반의 Annotation 수정


 수학적 알고리즘에 의한 유전자 예측으로 생각할 수 없었던 예외적인 사항이 많이 발생한다. 따라서 이러한 부분은 실제 유전자의 구조를 하나씩 살펴가며 수정 작업을 거쳐 최종적인 유전체 분석을 수행하게 된다. 분석 가능한 소프트웨어로는 Apollo[2] 와  Pedant-Pro가 있다. Apollo는 오픈 소스로 제공되며, Berkeley Drosophila Project 수행을 위해 Sanger Institute에서 개발하였다.

유전자의 구조 정보를 편집하기 위한 프로그램으로 evidence 데이터의 alignment 정보와 structural annotation 결과 형성된 Consensus Gene Model 정보를 같이 보며 수정 작업을 수행 한다(그림 12).

사용자 삽입 이미지
그림 12. Apollo. Consensus gene model의 정확성을 manually curation 한다. 유전자의 길이, 위치를 직접 편집하면서 가능한 AS form과 유전자 모델을 만들며, 이를 다시 xml혹은 GFF 형태로 저장하여 genome browser에 이용할 수 있도록 하였다.

입력 포맷으로 GFF3, Ensemble, XML 형식이 가능하며 Chado 데이터베이스로부터 직접 데이터를 읽어 들일수도 있다.  또한  삽입(Insertion), 삭제(Deletion), 확장(Extension), 분리(Split), 결합(Merge), 이동 그리고 변환(Replacement) 등 가능한 모든 유연한 편집 모드를 이용하여 유전자의 구조 정보를 편집할 수 있다. 또한 편집 시 필요한 주석 태그를 덧붙일 수 있는 것 또한 장점이라 할 수 있다.

 B. 기능 분석 결과의 수정(functional annotation)


 열 상동성 및 도메인 정보를 통해 분석되어진 유전자의 기능 정보에서 전문가의 분석에 의존하여 알고리즘에 의한 오류를 수정하거나 분석 정보를 편집, 수정할 수 있다. 이전 페이지에서 언급한 Pedant-Pro에서는 이와 같은 전문가의 수정 기능과 수정된 정보의 업데이트 기능을 지원하고 있어서 최종적으로 가장 정확한 유전체 분석 정보를 얻을 수 있다(그림 13). 수치상 상동성이 높은 단백질로 유전자 매핑이 이루어져야 하므로 발현 정보, 도메인 정보 등을 종합하여 단백질의 기능을 수정해야 할 때 이용하게 된다. 이러한 작업은 대부분 생물학적 지식을 갖춘 다수의 전문가들에 의해 진행되게 된다. 따라서 전문가에 의한 기능 분석 수정에 대한 이력 정보를 관리하는 것 또한 중요하다고 할 수 있다.

사용자 삽입 이미지
그림 13. Pedant-pro annotaton edition



다음주 연재에서는 NGS Application의 마지막 내용으로 Next Generation Sequencing 데이터를 분석하고 처리하는 Bioinformatics Knowledge Management에 대해 알아보겠습니다. 많은 관심 부탁드립니다.


참고문헌

 1. Lowe, T.M. and Eddy, S.R. (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25, 955-964.
 2. Lewis SE, et al. (2002). Apollo: a sequence annotation editor. Genome Biology. 12, research0082
 3. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 13, 229-243
 4. Stanke M, Schoffmann O, Morgenstern B, Waack S. (2006) Gene prediction in eukaryotes with a generalized hidden Markov model that uses hints from external  
 sources. BMC Bioinformatics. 7, 62. 
 5. Burge, C. and Karlin, S. (1997) Prediction of complete gene structures in human genomic DNA.  J. Mol. Biol.   268,  78-94.
 6. Salamov AA, Solovyev VV. (2000) Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA. Genome Res. 10, 516–522.
 7. Majoros, W.H., Pertea, M., and Salzberg, S.L. TigrScan and GlimmerHMM: two open-source ab initio eukaryotic gene-finders Bioinformatics 20, 2878-2879.
 8. G. Parra, E. Blanco, and R. Guigó, (2000) Geneid in Drosophila Genome Research 4, 511-515.
 9. Haas BJ, Salzberg SL, Zhu W, Pertea M, Allen JE, Orvis J, White O, Buell CR, Wortman JR. (2008) Automated eukaryotic gene structure annotation using  
 EVidenceModeler and the Program to Assemble Spliced Alignments. Genome Biology 9, R7
 10. Korf I. (2004) Gene finding in novel genomes. BMC Bioinformatics. 5, 59.
 11. Kan, Z., Rouchka, E.C., Gish, W., and States, D. 2001, Gene structure prediction and AS analysis using genomically aligned ESTs, Genome Res. 11, 889–900.
 12. Eyras, E., Caccamo, M., Curwen, V., and Clamp, M. 2004, ESTGenes: AS from ESTs in Ensembl, Genome Res. 14, 976–987.
 13. Kent, W.J. 2002, BLAT-The BLAST-Like Alignment Tool, Genome Res. 12, 565–664.
 14. Florea, L., Hartzell, G., Zhang, Z., Rubin, G.M., Miller, W. 1998, Computer program for aligning a cDNA sequence with a genomic DNA sequence, Genome Res. 8,
 967–974.
 15. Huang X, Adams MD, Zhou H, Kerlavage AR. (1997) A tool for analyzing and annotating genomic sequences. Genomics. 46, 37–45.
 16. Wu TD, Watanabe CK. (2005) GMAP: a genomic mapping and alignment program for mRNA and EST sequences. Bioinformatics. 21, 1859–1875.
 17. Birney E, Clamp M, Durbin R. (2004) GeneWise and Genomewise. Genome Res. 14, 988–995.

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이번 연재에서는 서로 다른 종간의 상응하는 유전자 조합 및 구성을 분석하여 진화론적인 유연관계를 밝히는 비교유전체 분석에  대해 알아보겠습니다.


B. 비교유전체 분석


 로 다른 종간의 상응하는 유전자 조합 및 구성을 분석하여 진화론적인 유연관계를 밝히는 비교유전체 분석의 가장 기본적인 분석은 ortholog 분석이다. Ortholog란 한 개체가 진화되어 여러 종으로 분화되었을 때, 유전자의 기능이 그대로 보존되어 서로 유사한 기능을 수행하는 것을 의미한다. 미생물의 경우 단순 ortholog 분석에서 확장되어 오페론 단위의 유전자 그룹을 유전체 상의 위치 정보와 함께 분석하는 Positional linkage 방법이 매우 정확하게 분석되고 있다(그림 10).

사용자 삽입 이미지
그림 10. Positional linkage. 미생물의 경우 보통 operon상에서 유사한 기능을 수행하는 단백질들끼리 서로 이웃하여 존재하므로 이를 positional linkage를 통해 정보를 확인한다.

 화론적인 연관관계 분석 시 이웃하고 있는 유전자의 배열과 조성을 통해 종간 변이 단계를 분석하게 된다. 좀 더 나아가 특정 ortholog 그룹의 유전자들의 존재 유무를 다수의 종에서 분석하여 프로파일링을 수행하고 그 프로파일을 이용하여 유연관계를 밝히는 phylogenetic 프로파일링 기법도 최근 매우 정확히 유전자의 기능을 예측하는 알고리즘으로 알려지고 있다. 비슷한 단백질 프로파일을 갖는 것은 비슷한 기능을 갖는다는 의미를 보여주기 때문에 유전자 기능 분석 시 이용되고 있다(그림 11).
사용자 삽입 이미지
그림 11. Phylogenetic 프로파일링



다음 연재에서는 수학적 알고리즘에 의한 유전자 예측으로 생각할 수 없었던 예외적인 사항이 많이 발생한다.  이러한 부분을 실제 유전자의 구조를 하나씩 살펴가며 수정 작업을 거치는 Professional Curation에 대해 알아보겠습니다. 많은 관심 부탁드립니다.


참고문헌

 1. Lowe, T.M. and Eddy, S.R. (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25, 955-964.
 2. Lewis SE, et al. (2002). Apollo: a sequence annotation editor. Genome Biology. 12, research0082
 3. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 13, 229-243
 4. Stanke M, Schoffmann O, Morgenstern B, Waack S. (2006) Gene prediction in eukaryotes with a generalized hidden Markov model that uses hints from external  
 sources. BMC Bioinformatics. 7, 62. 
 5. Burge, C. and Karlin, S. (1997) Prediction of complete gene structures in human genomic DNA.  J. Mol. Biol.   268,  78-94.
 6. Salamov AA, Solovyev VV. (2000) Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA. Genome Res. 10, 516–522.
 7. Majoros, W.H., Pertea, M., and Salzberg, S.L. TigrScan and GlimmerHMM: two open-source ab initio eukaryotic gene-finders Bioinformatics 20, 2878-2879.
 8. G. Parra, E. Blanco, and R. Guigó, (2000) Geneid in Drosophila Genome Research 4, 511-515.
 9. Haas BJ, Salzberg SL, Zhu W, Pertea M, Allen JE, Orvis J, White O, Buell CR, Wortman JR. (2008) Automated eukaryotic gene structure annotation using  
 EVidenceModeler and the Program to Assemble Spliced Alignments. Genome Biology 9, R7
 10. Korf I. (2004) Gene finding in novel genomes. BMC Bioinformatics. 5, 59.
 11. Kan, Z., Rouchka, E.C., Gish, W., and States, D. 2001, Gene structure prediction and AS analysis using genomically aligned ESTs, Genome Res. 11, 889–900.
 12. Eyras, E., Caccamo, M., Curwen, V., and Clamp, M. 2004, ESTGenes: AS from ESTs in Ensembl, Genome Res. 14, 976–987.
 13. Kent, W.J. 2002, BLAT-The BLAST-Like Alignment Tool, Genome Res. 12, 565–664.
 14. Florea, L., Hartzell, G., Zhang, Z., Rubin, G.M., Miller, W. 1998, Computer program for aligning a cDNA sequence with a genomic DNA sequence, Genome Res. 8,
 967–974.
 15. Huang X, Adams MD, Zhou H, Kerlavage AR. (1997) A tool for analyzing and annotating genomic sequences. Genomics. 46, 37–45.
 16. Wu TD, Watanabe CK. (2005) GMAP: a genomic mapping and alignment program for mRNA and EST sequences. Bioinformatics. 21, 1859–1875.
 17. Birney E, Clamp M, Durbin R. (2004) GeneWise and Genomewise. Genome Res. 14, 988–995.

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이번 연재에서는 유전자의 기능을 분석하는 Functional annotation 중에 먼저 상동성 기반의 Annotation에  대해 알아보겠습니다.

2-4-2. Functional annotation


 A. 상동성(homology) 기반의 Annotation


 전체 서열에서 유전자의 위치와 구조 정보를 파악하여 유전자의 서열을 분석한 뒤 그 서열 정보를 통해 유전자의 기능을 유추 한다. 가장 보편적으로 유전자의 기능을 분석하는 방법이 상동성 기반의 분석이다. 다만, 상동성 분석에 기반한 유전자 기능 유추 시 사용되는 데이터베이스에 따라 노이즈 발생률이 차이가 나므로 데이터베이스 구축에 많은 노력을 기우려야 한다. 분석하려고 하는 종과 동일한 종의 단백질 서열을 1차 데이터베이스로 구축하고 다음으로 유연  관계가 가까운 종을 대상으로 2차 데이터베이스를 만드는 피라미드 형태의 데이터베이스 구축이 필요하다. 또한 각 데이터베이스에 맞는 상동성 경계 값(cutoff) 조정이 필요하다. 단백질 수준에서의 상동성은 보통 높게는 1e-200에서 낮게는 1e-4 까지 적절한 수준으로 조정을 하게 된다. 그러나 DAN 수준에서의 상동성은 아무리 높은 e-value 경계 값이라도 신뢰할만한 정보가 되지 않는다고 말한다. 따라서 e-value 뿐만 아니라 identity, HSP coverage 등이 상동성 레벨을 정하는 기준이 되기도 한다.

 석에 이용되는 데이터베이스는 그 특성에 따라 약간의 차이가 있다(표 1). 단백질의 기능 규명을 위해 단백질의 1차 구조인 서열 정보부터 2차 구조정보인 도메인 정보, 3차 구조정보에 해당하는 PDB 정보 등 다양한 데이터베이스가 이용된다. 뿐만 아니라 세포내 위치 정보를 통해 기능을 유추하기도 하므로 세포내 위치 정보까지 가능한 모든 정보를 분석할 수 있는  흡사 유전자 기능 백화점과 같은 유전자 기능에 대한 정보 분석이 요구된다. 이러한 통합적인 유전자 기능 분석을 수행하기 위해서는 다양한 알고리즘과 데이터베이스, 분석 프로그램들의 유기적인 네트워크가 구축되어야 하며, 수많은 데이터의 입출력이 이루어지므로 데이터의 효율적인 관리를 위한 시스템도 연계되어야 되므로 상당히 복잡한 대규모 분석 시스템이 요구된다. BioMax사에서는 초기 인간 유전체 기능 분석부터 수백 종의 미생물, 다양한 척추동물, 식물 등의 기능 분석을 수행한 Pedant-Pro(http://www.biomax.com/products/pedantpro.php)라는 유전체 구조, 기능 분석 자동화 시스템을 서비스하고 있다.

사용자 삽입 이미지

Pedant-Pro에서는 크게 세 가지 카테고리로 구성된 데이터베이스를 통해 단백질의 기능을 규명하고 있다. 첫 번째, 단백질의 1차 구조인 서열정보를 이용한 분석으로 GO, MetaCat, FunCat, EC, COGs 데이터베이스를 활용한다(표 2).

사용자 삽입 이미지
단백질의 기능 분석은 DAG 구조를 이용한 계층화 방법으로 다중 기능을 수행하는 단백질의 특성에 맞게 GO와 FunCat을 이용하고 있으며, 그 중 MetaCat은 metabolization 분석에 이용되며 EC는 단백질의 enzymatic function에 각각 초점을 두어 이차적인 세포내 대사회로 분석의 기초자료를 제공하고 있다. COGs는 종간의 ortholog 그룹 정보를 데이터베이스로 구축한 것으로 유사 기능을 갖는 단백질들을 그룹화하여 기능을 유추하는데 도움을 주고 있다. 두 번째로는 단백질의 이차구조정보를 이용한 분석이다. 단백질의 hydrophobicity에 기반을 둔 transmembrane helice 및 site prediction을 수행하는 HMMTOP, TMHMM 그리고 단백질의 signal peptides 및 cleavage site를 예측하는 SignalP 분석이 이에 해당된다.

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그림 8. Pedant-Pro 유전자 기능 분석 결과 리포트.
Pedant-Pro의 유전자 구조, 기능 분석 리포트는 웹으로 확인할 수 있으며, 윈도우 방식의 디렉토리/폴더 구조로 각 분석 결과들이 구성되어 있으므로, 연구자가 쉽게 다양한 정보를 습득할 수 있다. 분석 결과 리포트는 다양한 공개 데이터베이스와의 연계 정보와 단백질의 도메인 정보, FunCat과 같은 기능 분류 정보등과 같은 다양한 특징적인 정보들을 볼 수 있다. 또한 단백질의 1차, 2차, 3차 구조에 대한 정보와 단백질의 Paralog 클러스터 정보 등을 확인할 수 있다.

 단백질의 서열 정보에 기반하여 얻어진 단백질 내의 도메인 정보는 프로파일 과정을 통해 서로 비슷한 도메인 프로파일을 갖는 단백질들 간의 클러스터 분석에 이용된다. 단순 서열 상동성에서 벗어나 좀 더 구체화된 기능을 중심으로 유전자의 기능을 유추하는 방법을 Pedant-Pro에서 제시하고 있다(그림 9). 유사한 방법으로 synteny 구조를 이용한 ortholog 분석이 있다.  유연관계가 가까운 종과의 synteny 분석을 이용해 유전자의 기능 뿐 아니라 염색체 내의 물리적 위치정보까지 이용하여 유전자의 기능을 규명하게 된다. 이들 방법들은 종간 ortholog 분석에 기초한 비교유전체 분야에 주로 이용되며 그 자세한 내용은 다음에서 다루도록 한다.
사용자 삽입 이미지
그림 9. 도메인 profile을 이용한 protein cluster 분석

다음 연재에서는 서로 다른 종간의 상응하는 유전자 조합 및 구성을 분석하여 진화론적인 유연관계를 밝히는 비교유전체 분석에  대해 알아보겠습니다. 많은 관심 부탁드립니다.



참고문헌

 1. Lowe, T.M. and Eddy, S.R. (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25, 955-964.
 2. Lewis SE, et al. (2002). Apollo: a sequence annotation editor. Genome Biology. 12, research0082
 3. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 13, 229-243
 4. Stanke M, Schoffmann O, Morgenstern B, Waack S. (2006) Gene prediction in eukaryotes with a generalized hidden Markov model that uses hints from external  
 sources. BMC Bioinformatics. 7, 62. 
 5. Burge, C. and Karlin, S. (1997) Prediction of complete gene structures in human genomic DNA.  J. Mol. Biol.   268,  78-94.
 6. Salamov AA, Solovyev VV. (2000) Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA. Genome Res. 10, 516–522.
 7. Majoros, W.H., Pertea, M., and Salzberg, S.L. TigrScan and GlimmerHMM: two open-source ab initio eukaryotic gene-finders Bioinformatics 20, 2878-2879.
 8. G. Parra, E. Blanco, and R. Guigó, (2000) Geneid in Drosophila Genome Research 4, 511-515.
 9. Haas BJ, Salzberg SL, Zhu W, Pertea M, Allen JE, Orvis J, White O, Buell CR, Wortman JR. (2008) Automated eukaryotic gene structure annotation using  
 EVidenceModeler and the Program to Assemble Spliced Alignments. Genome Biology 9, R7
 10. Korf I. (2004) Gene finding in novel genomes. BMC Bioinformatics. 5, 59.
 11. Kan, Z., Rouchka, E.C., Gish, W., and States, D. 2001, Gene structure prediction and AS analysis using genomically aligned ESTs, Genome Res. 11, 889–900.
 12. Eyras, E., Caccamo, M., Curwen, V., and Clamp, M. 2004, ESTGenes: AS from ESTs in Ensembl, Genome Res. 14, 976–987.
 13. Kent, W.J. 2002, BLAT-The BLAST-Like Alignment Tool, Genome Res. 12, 565–664.
 14. Florea, L., Hartzell, G., Zhang, Z., Rubin, G.M., Miller, W. 1998, Computer program for aligning a cDNA sequence with a genomic DNA sequence, Genome Res. 8,
 967–974.
 15. Huang X, Adams MD, Zhou H, Kerlavage AR. (1997) A tool for analyzing and annotating genomic sequences. Genomics. 46, 37–45.
 16. Wu TD, Watanabe CK. (2005) GMAP: a genomic mapping and alignment program for mRNA and EST sequences. Bioinformatics. 21, 1859–1875.
 17. Birney E, Clamp M, Durbin R. (2004) GeneWise and Genomewise. Genome Res. 14, 988–995.

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2010/03/22 11:19 2010/03/22 11:19


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이번 연재에서는 유전자 예측 프로그램과 단백질 서열을 유전체에 매핑하여 얻어진 Gene Model을 결합하는 유전체 모델의 결합(Gene model merging)에 대해 알아보겠습니다.

B-3. 유전체 모델의 결합(Gene model merging)


 서 설명한 유전자 예측 프로그램을 통해서 얻어진 Predicted Gene Model(PGM)과 mRNA, EST, 단백질 서열을 유전체에 매핑하여 얻어진 Evidenced Gene Model(EGM)을 합쳐 Consensus Gene Model(CGM)을 만든다. 각 유전자 모델마다 가중치를 다르게 설정하여 동일한 위치에서 중복적으로 지지를 받아 높은 score 합계를 갖는 유전자 모델이 CGM으로 채택이 된다[3].

 일반적으로 EGM이 PGM 보다 높은 가중치를 가지며 EGM 가운데에서도 full-length mRNA > protein> mRNA > EST 순으로 우선 순위를 배정한다. PGM도 evaluation을 통해 프로그램별 우선순위를 정해주기도 한다. CGM을 만드는 과정은 full-length mRNA를 가장 우선 순위로 채택하되, full-length mRNA가 없을 경우 단백질과 EST, PGM이 제공하는 정보를 통해 complete CGM을 형성한다(그림 5).

그림 5. Consensus Gene Model making


 몇 가지 예시를 통해 대표 되는 유전자 모델 형성 과정을 알아보도록 하자.
첫 번째 full-length mRNA를 통해 얻어진 EGM이 partial 단백질과 ESTs에 의해 공통적으로 exon/intron 정보를 제공 받아 complete CGM을 형성하였다(그림 6의 case1). 다음은 mRNA EGM이 없고 단백질 EGM이 가장 높은 가중치를 갖는 유전자 모델이 되어 EST 가 제공하는 3’ 정보를 통해 complete CGM을 형성한 경우 이다. 이때 EST EGM은 단백질 EGM의 partial 형태로 동일한 exon/intron 구조를 보이고 있다. 세 번째는 mRNA, 단백질 모두 존재하지 않고 partial ESTs EGM 만 존재할 때 EST EGM 하나 하나는 모두 낮은 가중치이나 동일한 위치에서 동일한 exon/intron 구조로 여러 ESTs EGM이 지지하고 있으므로 CGM을 형성할 수 있다. 또한 일정부분 동일한 유전자 구조를 갖는 PGM으로부터 3’ 정보를 제공 받아 complete CGM을 형성하였다. 마지막 네 번째 경우 세 번째 경우와 동일하게 PGM과 EST EGM이 존재하는 가운데 두 gene model이 서로 상이한 exon/intron구조를 보이고 있어 어떠한 CGM도 만들 수 없는 상황을 보여주고 있다. 만약 PGM 만이 존재할 경우라도 여러 프로그램을 통해 얻어진 PGM이 모두 동일한 exon/intron 구조를 갖는다면 CGM을 형성 할 수 있다. 대부분의 genome annotation에서 evidence 데이터를 충분히 갖추고 진행되기란 쉽지 않다. 따라서 종종 Evidenced Gene Model(EGM) 없이 Predicted Gene Model(PGM) 만으로 Consensus Gene Model(CGM)을 만드는 경우가 존재한다.

그림 6. Consensus gene model 만들기

이러한 유전자 모델을 형성하는 프로그램으로는 Tigr에서 공개 소스로 제공하는 EVModeler[9]가 있다. Perl 스크립트로 구성된 프로그램은 GFF3 포맷의 gene model 정보를 입력받아 정해진 gene model별 가중치를 토대로 Consensus Gene Model을 제시한다.
 

C. Alternative splicing analysis


다양한 유전자 모델을 통해 Consensus Gene Model을 형성하고 나면 이후 alternative splicing 분석을 위해 transcripts를 분석한다[12]. mRNA, ESTs, 단백질, NGS reads 서열이 제공하는 다양한 transcripts를 consensus gene model (CGM)에 비교하여 alternative transcript model을 제시 한다. 이후 조직 특이적인 alternative transcripts나 cancer specific alternative transcripts 분석으로 biological meaning에 초점을 두고 분석을 진행하게 된다[3].

그림 7. Alternative splicing 분석



다음 연재에서는 유전자의 기능을 분석하는 방법 중에 먼저 상동성 기반의 Annotation에  대해 알아보겠습니다. 많은 관심 부탁드립니다.


참고문헌

 1. Lowe, T.M. and Eddy, S.R. (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25, 955-964.
 2. Lewis SE, et al. (2002). Apollo: a sequence annotation editor. Genome Biology. 12, research0082
 3. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 13, 229-243
 4. Stanke M, Schoffmann O, Morgenstern B, Waack S. (2006) Gene prediction in eukaryotes with a generalized hidden Markov model that uses hints from external  
 sources. BMC Bioinformatics. 7, 62. 
 5. Burge, C. and Karlin, S. (1997) Prediction of complete gene structures in human genomic DNA.  J. Mol. Biol.   268,  78-94.
 6. Salamov AA, Solovyev VV. (2000) Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA. Genome Res. 10, 516–522.
 7. Majoros, W.H., Pertea, M., and Salzberg, S.L. TigrScan and GlimmerHMM: two open-source ab initio eukaryotic gene-finders Bioinformatics 20, 2878-2879.
 8. G. Parra, E. Blanco, and R. Guigó, (2000) Geneid in Drosophila Genome Research 4, 511-515.
 9. Haas BJ, Salzberg SL, Zhu W, Pertea M, Allen JE, Orvis J, White O, Buell CR, Wortman JR. (2008) Automated eukaryotic gene structure annotation using  
 EVidenceModeler and the Program to Assemble Spliced Alignments. Genome Biology 9, R7
 10. Korf I. (2004) Gene finding in novel genomes. BMC Bioinformatics. 5, 59.
 11. Kan, Z., Rouchka, E.C., Gish, W., and States, D. 2001, Gene structure prediction and AS analysis using genomically aligned ESTs, Genome Res. 11, 889–900.
 12. Eyras, E., Caccamo, M., Curwen, V., and Clamp, M. 2004, ESTGenes: AS from ESTs in Ensembl, Genome Res. 14, 976–987.
 13. Kent, W.J. 2002, BLAT-The BLAST-Like Alignment Tool, Genome Res. 12, 565–664.
 14. Florea, L., Hartzell, G., Zhang, Z., Rubin, G.M., Miller, W. 1998, Computer program for aligning a cDNA sequence with a genomic DNA sequence, Genome Res. 8,
 967–974.
 15. Huang X, Adams MD, Zhou H, Kerlavage AR. (1997) A tool for analyzing and annotating genomic sequences. Genomics. 46, 37–45.
 16. Wu TD, Watanabe CK. (2005) GMAP: a genomic mapping and alignment program for mRNA and EST sequences. Bioinformatics. 21, 1859–1875.
 17. Birney E, Clamp M, Durbin R. (2004) GeneWise and Genomewise. Genome Res. 14, 988–995.

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2010/03/19 10:24 2010/03/19 10:24

연재 순서

   1. Assembly
   2. Variation study
  3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis

이번 연재에서는 유전자 모델을 얻는 과정으로 서열 정보를 이용하여 유전체를 정렬(Genome alignment)하는 방법에 대해 알아보겠습니다.


B-2. 유전체 정렬(Genome alignment)


 전체 상에서 유전자의 위치 및 구조 정보를 파악하는데 가장 중요한 정보를 제공하는 것이 mRNA를 비롯한 실제 서열정보이다. 유전체 프로젝트를 수행하면서 Full-length mRNA 시퀀싱을 함께 진행하는 이유라고 할 수 있다. 그 외 단백질과 ESTs 서열도 유전자 구조 정보를 제공하는 좋은 재료이다[11]. 최대한 많은 양의 실제 데이터(evidence data)를 확보하여 유전체 서열과의 유사성(similarity)을 조사하고 그 위치를 파악한다. DNA 서열의 경우 BLAT[13], Sim4[14], GMAP[16], AAT[15]가 주로 이용되고, 단백질 서열의 경우 BLAST와 wise2 package에 존재하는 Genewise[17]를 이용한다. 유전체 서열이 매우 크므로 일차적으로 빠르게 매핑할 수 있는 BLAT이나 BLAST 등으로 대략의 위치를 설정하고 그 외 다른 프로그램을 이용하여 좀 더 정교한 2차 매핑을 수행하는 경우도 있다.

 이때, 서열상의 유사성에 의해 유전자 모델(Evidenced Gene Model)이 결정되므로 HSP length, coverage, identity와 같은 파라미터 조건을 엄격하게 설정하여 정확한 Evidenced Gene Model(EGM)을 만드는 것이 일반적이다. 또한 언급한 대부분의 프로그램은 모두 exon/intron 신호를 인지하며 local alignment을 수행하고 있어 intron이 존재하는 유전체 서열에 매핑 하기에 모두 적절한 프로그램이다.

 특히 genewise의 경우 매핑과 동시에 가능한 유전자 모델을 제시한다. 따라서 유전체 서열과 유연  관계가 가까운 이종의 단백질 서열을 매핑 하여도 좋은 결과를 얻을 수 있다. 다만, 이후 진행되는 consensus gene model을 만들 때 score를 적절히 조절 해야만 한다. 다양한 프로그램을 통해 얻어진 유전자 모델 정보는 모두 동일한 형태의 파일 포맷을 유지하는 것이 좋다. 대부분의 프로그램이 공통적으로 지원하는 파일 형태는 GFF3 포맷이다(그림 4).

사용자 삽입 이미지
그림. 4 GFF3 파일 포맷.
seqld/source(tool name)/type/start/end/score/strand/phase/attributes



다음 연재에서는 앞서 설명한 유전자 예측 프로그램과 단백질 서열을 유전체에 매핑하여 얻어진 Gene Model을 결합하는 유전체 모델의 결합(Gene model merging)에 대해 알아보겠습니다. 많은 관심 부탁드립니다.




참고문헌

 1. Lowe, T.M. and Eddy, S.R. (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25, 955-964.
 2. Lewis SE, et al. (2002). Apollo: a sequence annotation editor. Genome Biology. 12, research0082
 3. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 13, 229-243
 4. Stanke M, Schoffmann O, Morgenstern B, Waack S. (2006) Gene prediction in eukaryotes with a generalized hidden Markov model that uses hints from external  
 sources. BMC Bioinformatics. 7, 62. 
 5. Burge, C. and Karlin, S. (1997) Prediction of complete gene structures in human genomic DNA.  J. Mol. Biol.   268,  78-94.
 6. Salamov AA, Solovyev VV. (2000) Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA. Genome Res. 10, 516–522.
 7. Majoros, W.H., Pertea, M., and Salzberg, S.L. TigrScan and GlimmerHMM: two open-source ab initio eukaryotic gene-finders Bioinformatics 20, 2878-2879.
 8. G. Parra, E. Blanco, and R. Guigó, (2000) Geneid in Drosophila Genome Research 4, 511-515.
 9. Haas BJ, Salzberg SL, Zhu W, Pertea M, Allen JE, Orvis J, White O, Buell CR, Wortman JR. (2008) Automated eukaryotic gene structure annotation using  
 EVidenceModeler and the Program to Assemble Spliced Alignments. Genome Biology 9, R7
 10. Korf I. (2004) Gene finding in novel genomes. BMC Bioinformatics. 5, 59.
 11. Kan, Z., Rouchka, E.C., Gish, W., and States, D. 2001, Gene structure prediction and AS analysis using genomically aligned ESTs, Genome Res. 11, 889–900.
 12. Eyras, E., Caccamo, M., Curwen, V., and Clamp, M. 2004, ESTGenes: AS from ESTs in Ensembl, Genome Res. 14, 976–987.
 13. Kent, W.J. 2002, BLAT-The BLAST-Like Alignment Tool, Genome Res. 12, 565–664.
 14. Florea, L., Hartzell, G., Zhang, Z., Rubin, G.M., Miller, W. 1998, Computer program for aligning a cDNA sequence with a genomic DNA sequence, Genome Res. 8,
 967–974.
 15. Huang X, Adams MD, Zhou H, Kerlavage AR. (1997) A tool for analyzing and annotating genomic sequences. Genomics. 46, 37–45.
 16. Wu TD, Watanabe CK. (2005) GMAP: a genomic mapping and alignment program for mRNA and EST sequences. Bioinformatics. 21, 1859–1875.
 17. Birney E, Clamp M, Durbin R. (2004) GeneWise and Genomewise. Genome Res. 14, 988–995.


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2010/03/17 09:31 2010/03/17 09:31

연재 순서

   1. Assembly
   2. Variation study
  3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis

A. 반복서열 분석


 핵생물의 유전체 서열 중 반복 서열이 가장 많은 영역을 차지하고 있다. Transposon elements를 포함하여 simple repeat region, low complexity 영역이 전체 유전체의 약 70~ 80% 가량 해당된다. 따라서 반복서열 영역을 우선적으로 선별한 뒤 마스킹 작업을 통해 반복서열 영역에서의 유전자 예측은 예외로 처리한다. 물론, 반복서열 영역 내에도 단백질로 코딩 되는 부분이 존재 하지만, 극히 일부에 해당하기 때문에 추후에 따로 수행한다. 반복서열의 마스킹 작업은 주로 RepeatMasker (http://www.repeatmasker.org/) 분석 프로그램을 이용하여 진행한다. RepeatMasker는 유사성 기반의 검색을 통해 반복서열 데이터베이스에 존재하는 서열과 비교하여 유전체 내에 존재하는 transposon element와 retrotransposon element, rolling circles를 추출하고, TRF(tandem repeat finder)라는 서브 프로그램에 의해 단순반복 서열을 규명한다. 이때 종별로 특이적인 패턴을 가지는 반복서열이 (http://www.girinst.org/) 존재하므로 주기적으로 최신의 반복서열 데이터베이스를 업데이트하여 분석하는 것이 좋다. 2009년 11월 현재 Human을 포함하여 모두 26종에 대한 반복서열 데이터베이스를 제공하고 있으며, 연구자가 원하는 형태의 데이터베이스를 따로 구성하여 사용할 수도 있다. 

B. 유전자 모델링


 단백질로 코딩되는 유전자의 위치를 결정하는 일차적인 단계로 일반적으로 Ab initio 방식과 매핑 방식을 결합하여 사용한다. 이는 수학적 알고리즘을 통해 유전자의 위치를 예측하는 유전자 예측 과정과 실제 시퀀싱하여 밝혀진 mRNA, ESTs, 단백질 서열을 유전체 서열에 매핑하여 유전자 모델을 얻는 과정으로 구성된다.

 B-1. 유전자 예측


 유전자 예측 과정은 대부분 HMM 모델을 이용하여 서열상의 exon과 intron을 예측한다. exon과 intron사이의 ‘GT-AG’라는 splice signal을 인식하고 프로모터 영역과 3’ signal을 인지하는 방식으로 예측을 수행한다. 각 종마다 유전자 모델이 다르므로 정확한 유전자 모델을 설정하고 트레이닝 과정을 통해 종 특이적인 매트릭스를 형성하여 유전자 예측을 수행한다. 이때 예측 프로그램에 따라 연구자가 직접 매트릭스를 생성할 수 있도록 트레이닝을 수행할 수 있는 프로그램을 지원하는 공개용 예측 프로그램(Augustus[4], SNAP[10], GlimmerHMM[7])과 유료로 매트릭스를 구축, 제공하는 유전자 예측 프로그램(Fgenesh[6]), 그리고 주기적으로 업데이트된 매트릭스를 제공하는 프로그램(GeneId[8])으로 구분할 수 있다.  이들 중에서 가장 많이 사용되는 Softberry사의 Fgenesh는 다른 예측 프로그램에 비해서 정확성 및 신뢰성이 높아 국제적인 유전체 프로젝트에서도 이용되고 있다. Fgenesh는 유전자 예측 프로그램에서 가장 핵심이 되는 매트릭스를 제작하여 유료로 서비스하고 있으며, 일반적으로 매트릭스를 제작하는데 약 한 달 정도 분석을 수행한다. 고객은 mRNA, EST, 단백질 서열을 유전체 서열에 매핑 작업을 통해 정확한 유전자 모델을 제공하게 되고, Softberry사에서는 고객이 제공한 데이터와 공개되어 있는 서열을 대상으로 해당 유전체의 대표적인 유전자 모델 집단을 만든 후 매트릭스를 제작하게 된다. 이때, 제작된 매트릭스의 evaluation 자료도 함께 제공한다. 이후 유전자 예측 과정은 리눅스 환경에서 매우 간단하고 빠르게 진행된다. 분석 결과 또한 그림 3에서 보여 지는 것과 같이 유전자별로 TSS(transcription start site), CDS, polyA 등으로 유전체상의 위치 정보와 방향 정보를 알기 쉬운 구조로 제공하고 있다.

사용자 삽입 이미지
그림 3. Fgenesh 분석 결과


공개용 예측 프로그램으로 EBI에서 개발한 GeneId와 고전적인 예측 프로그램인 GenScan, GlimmerHMM과 Augustus 등이 주로 이용된다. 이들 모두 유전자 예측 프로그램의 사용 시에는 간단한 명령어로 유전자 예측을 수행한다. Augustus의 경우 분석 속도가 다른 프로그램들에 비해 느린 단점이 있다. 유전자 예측은 일반적으로 하나의 프로그램만을 사용하지 않고 여러 개의 프로그램을 동시에 사용하여 여러 개의 유전자 예측 모델을 생성한다. 이 후 유전자의 엑손, 인트론 단위로 규정화 되어있는 scoring 방식을 통해 여러 프로그램에서 중복적으로 예측된 유전자 모델을 우선적으로 채택하게 된다. 이러한 scoring 방식은 뒷부분에서 자세히 다루도록 한다.


다음 연재에서는 서열 정보를 이용하여 유전체를 정렬(Genome alignment)하는 방법에 대해 알아보겠습니다. 많은 관심 부탁드립니다.


참고문헌


 1. Lowe, T.M. and Eddy, S.R. (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25, 955-964.
 2. Lewis SE, et al. (2002). Apollo: a sequence annotation editor. Genome Biology. 12, research0082
 3. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 13, 229-243
 4. Stanke M, Schoffmann O, Morgenstern B, Waack S. (2006) Gene prediction in eukaryotes with a generalized hidden Markov model that uses hints from external  
 sources. BMC Bioinformatics. 7, 62. 
 5. Burge, C. and Karlin, S. (1997) Prediction of complete gene structures in human genomic DNA.  J. Mol. Biol.   268,  78-94.
 6. Salamov AA, Solovyev VV. (2000) Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA. Genome Res. 10, 516–522.
 7. Majoros, W.H., Pertea, M., and Salzberg, S.L. TigrScan and GlimmerHMM: two open-source ab initio eukaryotic gene-finders Bioinformatics 20, 2878-2879.
 8. G. Parra, E. Blanco, and R. Guigó, (2000) Geneid in Drosophila Genome Research 4, 511-515.
 9. Haas BJ, Salzberg SL, Zhu W, Pertea M, Allen JE, Orvis J, White O, Buell CR, Wortman JR. (2008) Automated eukaryotic gene structure annotation using  
 EVidenceModeler and the Program to Assemble Spliced Alignments. Genome Biology 9, R7
 10. Korf I. (2004) Gene finding in novel genomes. BMC Bioinformatics. 5, 59.
 11. Kan, Z., Rouchka, E.C., Gish, W., and States, D. 2001, Gene structure prediction and AS analysis using genomically aligned ESTs, Genome Res. 11, 889–900.
 12. Eyras, E., Caccamo, M., Curwen, V., and Clamp, M. 2004, ESTGenes: AS from ESTs in Ensembl, Genome Res. 14, 976–987.
 13. Kent, W.J. 2002, BLAT-The BLAST-Like Alignment Tool, Genome Res. 12, 565–664.
 14. Florea, L., Hartzell, G., Zhang, Z., Rubin, G.M., Miller, W. 1998, Computer program for aligning a cDNA sequence with a genomic DNA sequence, Genome Res. 8,
 967–974.
 15. Huang X, Adams MD, Zhou H, Kerlavage AR. (1997) A tool for analyzing and annotating genomic sequences. Genomics. 46, 37–45.
 16. Wu TD, Watanabe CK. (2005) GMAP: a genomic mapping and alignment program for mRNA and EST sequences. Bioinformatics. 21, 1859–1875.
 17. Birney E, Clamp M, Durbin R. (2004) GeneWise and Genomewise. Genome Res. 14, 988–995.

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2010/03/16 10:56 2010/03/16 10:56

연재 순서

   1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis


이번 연재에서는 약 2주에 걸쳐 유전체 내의 유전자 위치와 기능을 해독하는 과정인 Genome Annotation에 대해 연재가 될 예정입니다. 오늘은 Genome Annotation 중에서도 첫번째 단계인 유전체 서열 내에서 유전자의 위치와 구조 정보를 밝혀내는 Structural annotation에 대해 알아보겠습니다.

2-4. Genome Annotation


 2009년 현재 human을 비롯한 mammalian에서 microbial까지 많은 유전체 프로젝트가 완료되었거나 진행되고 있으며, NCBI의 사이트에서 그 내용을 확인할 수 있다. 이렇게 다양한 종에서 완료되었거나 진행 중인 유전체 프로젝트는 NGS 시대를 맞이하여 더욱 가속화 되었다. 유전체 프로젝트는 유전체 서열을 시퀀싱을 통해 추출하는 단계와 유전체 내의 유전자 위치와 기능을 해독하는 단계로 구성된다. 여기서 유전체 내의 유전자 위치와 기능을 해독하는 과정을 genome annotation이라고 정의하며, genome annotation은 세 가지 과정으로 구분할 수 있다. 유전체 내의 유전자에 대한 구조적 정보를 분석하는 structural annotation, 유전자의 기능을 규명하는 functional annotation, 그리고 마지막으로 수학적 알고리즘으로 밝혀지지 않는 부분을 생물학 전문가가 면밀히 분석하는 manual curation 과정으로 구성되어 있다. 이번 장에서는 genome annotation에 대한 세 가지 과정에 대하여 구체적으로 알아보고자 한다.

 2-4-1. Structural annotation

 
 Genome annotation의 첫 번째 단계인 structural annotation은 유전체 서열 내에서 유전자의 위치와 구조 정보를 밝혀내는 것을 목적으로 하여 유전체 서열 전체의 유전자 지도를 완성한다. 유전체 서열에는 실제 단백질을 코딩하는 유전자 영역과 그 외 나머지 영역으로 크게 나눠진다. 그중 유전자는 exon과 intron으로 나눠지고 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 영역이 일반적으로 유전자의 앞단에 위치하고 있다(그림 1).

사용자 삽입 이미지
그림 1. Structural annotation.
유전체 내의 유전자의 위치 정보와 상세 구조정보를 규명한다.

 또한 유전체 서열의 상당 부분을 차지하고 있는 반복 서열과 transposon elements 들도 유전체의 다양한 영역에 존재하고 있다. 인간 유전체의 경우 약 30억 쌍의 염기서열 중 실제 단백질로 코딩되는 영역인 엑손 영역은 전체 염기 중 단 1%에 불과하다. 99%의 나머지 서열은 non-cording RNA, intron, repeat, regulation 영역이 대부분 차지하고 있다. 따라서 유전체에서 여러 가지 형태의 서열들에 대한 위치 정보를 다양한 데이터베이스와 알고리즘을 이용하여 분석하고 있으며, 과정은 다음과 같다(그림 2).

사용자 삽입 이미지
그림 2. Structural annotation 워크플로우.
Ab initio 와 유전체 매핑을 결합한 방식.




다음 연재에서는 진핵생물의 유전체 서열 중 가장 많은 영역을 차지하는 반복서열 분석법과 유전자 모델링 중에서 유전자의 위치를 예측하는 유전자 예측에 대해 알아보겠습니다.
많은 관심 부탁드립니다.


참고문헌

 1. Lowe, T.M. and Eddy, S.R. (1997) tRNAscan-SE: a program for improved detection of transfer RNA genes in genomic sequence. Nucleic Acids Res. 25, 955-964.
 2. Lewis SE, et al. (2002). Apollo: a sequence annotation editor. Genome Biology. 12, research0082
 3. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 13, 229-243
 4. Stanke M, Schoffmann O, Morgenstern B, Waack S. (2006) Gene prediction in eukaryotes with a generalized hidden Markov model that uses hints from external  
 sources. BMC Bioinformatics. 7, 62. 
 5. Burge, C. and Karlin, S. (1997) Prediction of complete gene structures in human genomic DNA.  J. Mol. Biol.   268,  78-94.
 6. Salamov AA, Solovyev VV. (2000) Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA. Genome Res. 10, 516–522.
 7. Majoros, W.H., Pertea, M., and Salzberg, S.L. TigrScan and GlimmerHMM: two open-source ab initio eukaryotic gene-finders Bioinformatics 20, 2878-2879.
 8. G. Parra, E. Blanco, and R. Guigó, (2000) Geneid in Drosophila Genome Research 4, 511-515.
 9. Haas BJ, Salzberg SL, Zhu W, Pertea M, Allen JE, Orvis J, White O, Buell CR, Wortman JR. (2008) Automated eukaryotic gene structure annotation using  
 EVidenceModeler and the Program to Assemble Spliced Alignments. Genome Biology 9, R7
 10. Korf I. (2004) Gene finding in novel genomes. BMC Bioinformatics. 5, 59.
 11. Kan, Z., Rouchka, E.C., Gish, W., and States, D. 2001, Gene structure prediction and AS analysis using genomically aligned ESTs, Genome Res. 11, 889–900.
 12. Eyras, E., Caccamo, M., Curwen, V., and Clamp, M. 2004, ESTGenes: AS from ESTs in Ensembl, Genome Res. 14, 976–987.
 13. Kent, W.J. 2002, BLAT-The BLAST-Like Alignment Tool, Genome Res. 12, 565–664.
 14. Florea, L., Hartzell, G., Zhang, Z., Rubin, G.M., Miller, W. 1998, Computer program for aligning a cDNA sequence with a genomic DNA sequence, Genome Res. 8,
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 15. Huang X, Adams MD, Zhou H, Kerlavage AR. (1997) A tool for analyzing and annotating genomic sequences. Genomics. 46, 37–45.
 16. Wu TD, Watanabe CK. (2005) GMAP: a genomic mapping and alignment program for mRNA and EST sequences. Bioinformatics. 21, 1859–1875.
 17. Birney E, Clamp M, Durbin R. (2004) GeneWise and Genomewise. Genome Res. 14, 988–995.

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2010/03/15 13:34 2010/03/15 13:34

[Quipu Issue Paper] Epigenomics Ⅱ - ChIP-seq

연재 순서

   1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis

이번주 연재에서는 Next Generation Sequencing의 세 번째 Application인 Epigenomics 중에 단백질에 binding된 DNA 서열을 분리하여 NGS 방식의 시퀀싱을 통해 binding site를 동정하는 방법인 CHIP-Seq 분석 방법에 대해 알아보겠습니다.

2-3-2. ChIP-seq


 CHIP(chromatin-immunoprecipitation)은 특정 유전체 영역에 binding 하는 히스톤이나 전사 인자(Transcription Factors, TFs)와 같이 특정 DNA서열에 binding 하는 단백질과 genomic fragments를 분리하기 위해 많이 응용 되어 왔다. 이 기술은 빠르게 발전하여 large-scale의 TF-DNA interactions 혹은 chromatin packaging (histone modification을 통한 genomic DNA와의 packaging) 연구에 중심 기술로 자리 잡았다. CHIP-Seq은 기존의 CHIP-chip에서 보여 지던 해상도의 한계와 chip에 올려 진 프로브에 대한 한계를 극복하는 방법으로 단백질에 binding된 DNA 서열을 분리하여 NGS 방식의 시퀀싱 통해 binding site를 동정하는 방법으로 발전하였다(그림 3). 그 결과 genome wide epigenetic study가 가능하게 되었다.

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그림 3. CHIP-Seq을 이용한 단백질 binding site 규명.
Genomic DNA와 특정 단백질의 binding 후 단백질 specific antibody를 이용하여 
분리한다. 이후 단백질을 제거하고 NGS 기술을 이용하여 시퀀싱 한다[5].

 CHIP-seq은 실험적으로 짧은 DNA 절편에 binding하는 특성 때문에 non-specific binding complex의 background 처리가 반드시 필요하다. 이를 해결하기 위해 실험적으로는 antibody 만을 사용한 대조군을 설정하여 비교하는 방법과, 통계학적으로는 주어진 단백질이 주어진 위치에 정확하게 binding 할 확률을 계산하도록 하는 것이다. 이때 genome 전체 서열(g)에 주어진 서열(t)이 정확하게 mapping될 확률은 t/g로 포아송 분포 (poisson distribution) 혹은 negative binomial distribution을 이용하여 추정하게 된다[3].
 이후 consensus binding sequence를 도출하게 되면 이를 데이터베이스로 하여 다른 종의 분석에 이용할 수 있게 된다. 이렇게 TF와 그에 관련된 정보로 전문화 하여 구축된 데이터베이스 중 거의 유일한 곳이 BIOBASETRANSFAC이다(그림4)[6].

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그림 4. TRANSFAC.
Transcription factor와 binding site 및 관련
pathway정보를 담고 있는 유일한 TF database.

 TRANSFAC은 genome내의 유전자 upstream 분석에 기초 자료를 제공하여 유전자 조절 메카니즘 분석에 필수적으로 이용되고 있다. 실험적으로 검증된 TF의 정보를 manual curation을 통해 고품질의 데이터를 쌓아가고 있으며, 그간 CHIP-chip 방식의 데이터로 밝혀지던 정보들이 CHIP-seq 방식의 데이터로 전환 되면서 더욱 빠르게 진행되고 있어 이를 이용한 BIOBASE의 데이터베이스 또한 더욱 빠르게 쌓여갈 것으로 예상된다. 뿐만 아니라 이미 human의 경우 모든 유전자의 upstream을 분석하여 binding 가능한 TF를 제공하고 있으며, 이를 이용한 pathway 분석에도 많은 데이터와 분석 프로그램을 제공하고 있다. 그중 TRANSPATH는 affymatrix data를 이용한 발현 분석 시 DEGs의 pathway를 분석하는데 해당 유전자의 upstream에 존재하는 TFs와 관련 pathway를 분석하여 세포내 전체적인 유전자의 기능을 살펴볼 수 있도록 하였다[6].

 이러한 CHIP-Seq은 다양한 플랫폼에서 분석이 가능한 가운데, CLC NGS Cell을 이용하여 assembly를 진행하게 되면 genbank 형식의 ‘.gbk' 파일을 reference로 사용하여 GUI 형태로 유전체 전체의 분포를 확인할 수 있어 데이터 해석의 용이함을 얻을 수 있다(1-2. Assemble 참조). 또한 비슷하게 Illumina의 Genome Analyzer의 경우 ChIP-seq 분석을 통해 얻어진 작은 서열들을 ELAND를 이용하여 유전체에 정렬하게 되고 그 결과는 UCSC genome browser를 통해 유전체 내의 위치와 분포를 확인할 수 있다(그림 5).

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그림 5. UCSC genome browser를 통한 TF binding site의 유전체 내 위치 확인.
붉은색으로 정렬된 바는 NGS로 시퀀싱 되어진 reads로
유전체와의 reference assemble를 통해 위치를 확인한다.[4]





다음 연재에서는 약 2주에 걸쳐 유전체 내의 유전자 위치와 기능을 해독하는 과정인 genome annotation에 대해 알아보겠습니다.
많은 관심 부탁드립니다.


참고문헌

 1. Horner DS, Pavesi G, Castrignanò T, De Meo PD, Liuni S, Sammeth M, Picardi E, Pesole G. (2009) Bioinformatics approaches for genomics and post genomics applications of next-generation sequencing. Brief Bioinform. [Epub ahead of print]
 2. Weber M, Schubeler D. (2007) Genomic patterns of DNA methylation: targets and function of an epigenetic mark. Curr Opin Cell Biol. 19, 273-80
 3. Roch 454 : Applications - Epigenetics
 (http://www.454.com/applications/ChIP-seq-methylation-epigenetics.asp)
 4. Illumina : Applications - Gene Regulation and Epigenetic Analysis
 (http://www.illumina.com/applications.ilmn#dna_protein_interaction_analysis_chip_seq)
 5. Appied Biosystems : Applications & Technologies - The SOLiD System
 (http://www3.appliedbiosystems.com/AB_Home/applicationstechnologies/SOLiD-System-Sequencing-A/index.htm)
 6. Kel, A., Voss, N., Jauregui, R., Kel-Margoulis, O. and Wingender, E. (2006) Beyond microarrays: Find key transcription factors controlling signal transduction pathways BMC Bioinformatics. 7, S13



Posted by 人Co

2010/03/12 08:18 2010/03/12 08:18

 난 2월 26일(금) Systems Biology 전문 소프트웨어 개발회사인 Ariadne Genomics사에서 Anton Yuryev 박사가 내한하였습니다. Anton Yuryev 박사는 이번 세미나에서 nutrigenomics, toxicogenomics와 biomarker발굴 연구에 응용할 수 있는 Pathway Studio 프로그램의 다양한 분석 활용에 대해 소개해주셨습니다.

 세미나는 26일 하루 동안 서울과 대전 두 곳에서 바쁘게 진행되었습니다. 먼저 오전에 서울대학교 약학대학에서는 서울 근교 지역에서 여러 분들이 참석을 해주셨습니다. 서울대학교 분석약학실의 권성원 교수님의 Anton박사 약력 소개와 이어 (주)인실리코젠의 Codes팀 박준형 팀장님께서 이날 세미나의 취지에 대해 말씀해 주시는 것으로 세미나가 시작되었습니다. Anton박사는 Pathway Studio에 대한 간략한 소개와 skin care에 대한 새로운 idea, 다양한 물질에 대한 toxicity mechanism, drug action mechanism, disease pathway 등 다양한 case study를 Pathway Studio 이용하여 어떻게 분석할 수 있는지에 대해 설명해 주셨습니다.

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1시간 30분간의 서울에서의 세미나 일정을 마치고 간단하게 점심을 먹고 대전으로 향했습니다. 점심을 먹는 동안에는 김연아 선수의 프리스케이팅 경기가 있었습니다. Anton Yuryev 박사님께 김연아 선수에 대한 소개도 해드리고 함께 경기를 지켜보았습니다. 김연아 선수의 좋은 성적으로 기분 좋게 대전으로 출발할 수 있었던 것 같습니다.

 전에서는 한국생명공학연구원에서 세미나가 진행되었는데 한국생명공학연구원분들과 KAIST 그리고 멀리 부산에서도 참석하여 함께 자리를 빛내주셨습니다. 세미나에 대한 소개를 시작으로 Anton Yuryev 박사의 세미나가 시작되었습니다. 세미나는 서울에서와 마찬가지로 Pathway Studio에 대한 간략한 소개와 drug epositioning and combination therapy design이라는 주제에 중점을 둔 case study 내용으로 진행되었습니다. 세미나가 끝나고 멀리 있어서 자주 찾아뵙지 못하는 분들과 반갑게 대화를 나누는 시간도 잠시 가졌습니다.

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  렇게 26일의 서울과 대전의 바쁜 일정을 마치고 27일(토)에는 Anton Yuryev 박사께서 직접 저희 회사에 방문해 주셔서 내부 세미나를 진행해주시기도 하였습니다. 한층 더 업그레이드된 ResNet Database curator, MedScan 기술, 그리고 Pathway Studio의 API에 대해 Training을 받았습니다. 저희 회사에서 앞으로 Pathway Studio 컨설팅을 하는데 있어서 도움이 될 수 있는 내용에 대해 배우는 중요한 시간이 되었습니다.

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  다시 한 번 바쁘신 와중에도 지난 26일(금)에 세미나에 참석해 주신 모든 분들께 진심으로 감사드리며, 이번에 개최된 세미나가 많은 분들께 유익한 시간이 되었기를 바랍니다. 앞으로도 저희 (주)인실리코젠에서는 세미나를 진행함에 있어 부족한 점들을 지속적으로 보완하여 세미나에 참여하시는 모든분들께 보다 새롭고 다양한 정보를 제공할 수 있도록 노력하겠습니다. 발표 내용이나 PathwayStudio에 대한 문의사항이 있으시면 언제든지 대표전화(031-278-0061) 또는 Codes팀(codes@insilicogen.com)으로 문의하여 주십시오.

감사합니다.




Posted by 人Co

2010/03/09 17:46 2010/03/09 17:46



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