ChIP-Seq 분석은 어떻게 하는건가요?

ChIP-Seq


ChIP 은 Chromatin Immunoprecipitation의 약자로 세포내에서 이뤄지는 단백질과 DNA간의 상호작용을 알아내는 주요한 방법으로 특정 단백질과 binding 하는 DNA sequence 를 알아내는 것을 목적으로 합니다. 특정 단백질과 결합된 DNA을 면역학적 방법인 antibody를 이용하여 침강시킨후 결합된 DNA를 따로 분리하여 그 sequence를 확인합니다. 이때, 해당 서열을 확인 하는 방법으로 microarray방식을 이용하면, ChIP-chip이 되고, NGS와같은 시퀀싱 방식을 이용하면 ChIP-seq이 됩니다. 이러한 방법은 유전자 발현을 조절하는 전사조절인자(transcription factor)의 bindig site와 기작을연구하는데 많이 이용되고 있습니다.

예를 들어 transcription factor A의 binding-site를 분석하기 위해, 먼저 세포내에서 transcription factor A와 DNA를 결합시킨 후 그 결합을 고정하기 위해 sample을 포름알데히드와 같은 고정액으로 고정시킵니다. 이후 세포를 lysis하여 DNA 전체를 분리한 다음 sonication 방법으로 DNA를 잘게 조각냅니다. 그러면 transcription factor와 결합된 상태의 DNA 조각과 그렇지 않은 조각이 생성됩니다. 이후 원하던 transcription factor A에 binding된 DNA 조각만을 분리하기 위해 transcrition factor A 특이적인 antibody와 beads 붙여 원심분리를 통해 transcription factor A와 이에 결합된 DNA만을 분리해 낼 수 있습니다. 마지막으로 분리된 transcription factorA와 DNA 사이의 결합을 끊어 DNA만을 분리해낸 다음 앞서 언급한 microarray방식과 NGS 기술을 이용한 시퀀싱 방식을 통해 각각 확인할수 있습니다. Microarray방식은 유전체상의 대부분의 영역을 microarray probe로 제작하여 chip에 심은 후 transcription factor A와 결합되었던 DNA조각을 binding 시켜 확인하게 되며, 시퀀싱 방식은 분리된 DNA조각을 직접적으로 시퀀싱을 통해 확인하게 됩니다. 이후 시퀀싱된 서열을 해당 유전체 서열에 mapping(reference assembly)을 통해 유전체 상의 binding location을 확인 합니다. 이들 모두 공통적으로 transcription factor A가 binding 하는 서열정보를 비롯하여 유전체내의 binding location을 함께 확인 할 수 있어 이차적으로 전자를 조절 받는 유전자 프로파일을 함께 확인 할수 있는 이점이 있습니다.

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단백질과 binding 되는 DNA 서열이 짧기 때문에 , ChIP-Seq 분석을 할 때는 일반적으로 short read로 시퀀싱을 진행합니다. 또한 reference 서열에 mapping 할 때 역시 mapping 파라메터들을 엄격하게 설정하여 noise data의 생성을 예방합니다. 시퀀싱 reads의 서열들이 짧기 때문에 적은 bp의 mismatch나 gap일 지라도 실제 binding site가 아닌 엉뚱한 위치에 mapping될 확률이 높아 지므로 최종적으로 ChIP peak를 찾기 힘들어지게 될 수 있습니다. Mapping view를 보면 이렇게 특정 단백질에 특이적인 binding-site에만 read들이 mapping 되어 형성되는 'peak'을 확인 하실수 있습니다(Candidated transciption factor A binding position).

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Peak 영역에 mapping된 read의 수와 전체 reference 서열의 mapping 된 read의 분포, 그리고 control 데이터에 mapping된 read의 분포 등을 고려하여 관찰되는 peak가 false positive인지 false negative인지 통계적으로 유의성을 검증할 수 있습니다. CLC Genomics Workbench를 이용하면 이렇게 찾아진 ChIP peak들에 대한 정보가 담긴 테이블과 해당 ChIP peak가 위치한 부분의 mapping view를 한 화면에서 확인할 수 있습니다.

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그리고 mapping view를 조금 더 축소해 보면 해당 peak의 upstream과 downstream에 위치한 유전자를 확인하여, 어떤 유전자들이 해당 transcription factor A에 영향을 받을지 유추해 볼 수 있습니다.

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부가적으로 BIOBASE사의 'TRANSFAC' 데이터베이스는 발표된 모든 논문들을 대상으로 생물 전문 큐레이터들이 검토하여 transcription factor와 transcription factor binding site에 대한 정보를 축적하고 있습니다. 또한 이렇게 형성된 TRANSFAC의 데이터는 보다 효율적으로 연구자들에게 공급하기위해 CLC Genomics Workbench에서 plug-in을 통해 ChIP-seq을 통해 찾아진 peak와 직접적으로 비교하여 관련된 유전자, 질병 및 mutation에 대한 다양한 정보를 제공 하고 있습니다.



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2012/06/11 15:03 2012/06/11 15:03
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BKL TRANSFAC

 Biobase의 대표적인 제품군인 TRANSFAC은 eukaryotic gene regulation을 분석하기 위한 최적의 기초 데이터를 제공하고 있다. Transcription factors, miRNAs, 그리고 이들과 관련된 유전자의 프로모터 정보를 비롯하여 ChIP-Seq 데이터로부터 1,000,000건 이상의 binding sites 정보, 57,000건 이상의 human RNA polymeraseII의 위치정보를 포함하고  있다. 이들 정보는 모두 실험적으로 증명 되었거나 논문에 게재된 정보를 전문가의 리뷰를 통해 정확하면서도 통합적인 이해를 할 수 있도록 하였다.

 2010년 현재 TRANSFAC®의 데이터베이스는 DNA binding, expression 그리고 regulation에 관련한 전문가의 manual curation을 다음과 같이 수행하였다.

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이들 데이터는 실험적으로

  • transcription factor binding site나 혹은 composite elements를 증명하고자       할 때,
  • promoter sequence를 찾고자 할 때
  • miRNA targets을 찾고자 할 때
  • 관심 있는 영역에 binding 가능한 transcription factor를  찾고자 할 때
  • transcription factor들 간의 조절을 알고자 할 때
 실험에 앞서 가능한 factor들의 기초 정보를 제공하게 된다. 따라서 microarray를 통한 유전자 발현 패턴을 분석했다면 동일한 발현 패턴을 보이는 유전자들의 상관관계를 분석하는데 많이 이용되며, 약리 반응이나 신물질의 target을 밝히는 데에도 기초 자료로 인용되고 있다.


TRANSFAC®의 데이터 구성


 TRANSFAC® Professional은 공개된 데이터에 비해 약 4년 정도의 데이터가 업데이트되어 있는 상태로 그 데이터양은 promoter서열이 약 280,000건, 700,000건의 ChIP-chip/-Seq 데이터를 더 포함하고 있다(figure 1).

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Figure 1. Public database와 Professional version의 데이터양의 차이


이들의 자세한 내용은 figure 2에서 보여 지는 것과 같이 transcription factor의 서열 정보를 비롯한 binding 가능한 site정보, 도메인정보, regulation 정보를 총체적으로 담고 있다.

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Figure 2. Transcription factor feature. Transcription factor의 서열 정보, 종 정보, 조직 정보, 도메인 정보, binding site 정보, interaction protein 정보, regulation정보를 총체적으로 서비스하고 있다.

 GO category정보 및 pathway정보도 가능한 모두 서비스가 되고 있어 세포내 생물학적 기능을 종합적으로 분석하고자 할 때 기초자료로 많은 정보를 주고 있다(figure3).

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Figure 3. Transcription factor의 function 정보. Factor간의 interaction정보, pathway 정보, inhibitor 및 activator와 같은 regulation 정보 등을 문헌자료를 통해 데이터베이스화하고 서비스한다.



미지의 서열에 binding 가능한 transcription factor search.


 특정한 발현 패턴을 보이는 유전자의 발현 조절 메커니즘을 분석 하고자 할 때 기본적으로 유전자의 upstream 영역에서 작용하는 transcription factor(TF)를 알아보게 된다. TRNASFAC®은 기본적인 transcription factor 및 binding site에 대한 정보를 제공함과 동시에 미지 서열에 binding 가능한 transcription factor를 예측할 수 있는 MatchTM, PatchTM, 그리고 Catch® 프로그램도 제공하고 있다(Figure 4).

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Figure 4. TRANSFAC Professional의 TF search를 위한 PATCH. Pattern match를 통한 미지의 서열에 binding 가능한 TF를 search한다. 이때 false positive를 최소화하기 위해 찾고자 하는 TF의 종 정보를 제한하여 식물 유전자의 경우 식물 데이터베이스를 사용하고 mamalian 유전자의 경우 mamalian 데이터베이스를 사용한다. 또한 특정 찾고자 하는 TF만을 대상으로 할 경우 분석자에 의해 선택된 TF만으로 구성된 프로파일을 제작하여 분석할 수도 있다.


 MatchTM는 TF의 binding site를 matrix로 구성하여 찾는 방법이며, PatchTM는 서열의 pattern match 방법을 이용하여 찾는 방법이다. Catch®는 composite elements를 찾고자 할 때 사용하게 되는데 보통 이들 프로그램을 모두 사용하여 가능한 모든 TF를 찾고 실험에 이용한다. 또한 실험적으로 하나하나 규명할 수도 있으나 유전체 전체 유전자를 대상으로 분석하고자 할 때, 웹으로 운영되는 다음 프로그램에 서열을 하나씩 분석하기는 매우 어려우므로 local 서버나 PC에 설치하여 batch로 서열을 분석할 수도 있다. 이후 얻어진 유전자의 upstream 영역에서 작용하는 TF의 profile정보는 통계적 기법을 통해 유의한 TF를 선별하기도 하고, 데이터베이스화하기도 한다.

또한 얼마 전 덴마크의 CLCBio사와의 협력을 통해 CLCMainWorkbench 혹은 CLCGenomicsWorkbench의 plug-in 기능을 통해 TF정보를 visualization 할 수도  있게 되었다. 따라서 NGS에 의한 RNA-seq 정보 및 유전자 발현정보와 함께 전사조절 ,    메커니즘까지 확대하여 함께 분석할 수 있는 최적의 데이터를 제공하고 있는 것이다.

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2010/04/27 14:55 2010/04/27 14:55

연재 순서

   1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
  5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis



이번 연재에서는 NGS Edition의 마지막 연재로 대용량의 데이터를 다루기 위한 Centralization for High-throughput Data Analysis에 대해 알아보도록 하겠습니다.

3-5. Centralization for High-throughput Data Analysis


 최근 들어 분석하고자 하는 데이터의 용량이 기하급수적으로 늘어남에 따라 데스크탑 컴퓨터 사양으로 분석하기가 어려워지고 있다. 따라서 생물정보 전문가들의 도움이 많이 요구되지만, 한 두 명의 생물정보 전문가들이 처리하기에는 분석하고자 하는 데이터가 급격하게 증가되고 이를 활용한 연구 분야가 다양하여 대규모의 생물정보 전문가를 가용하고 있는 센터가 아닌 곳에서 모든 분석을 지원하는 것은 쉽지가 않다. 또한 유전체 분석과 같은 대규모 프로젝트가 컨소시엄 형식으로 수행되고 있는 상황에서는 다른 연구팀과의 상호 협조를 통한 공동 연구가 중요하며, 이를 위한 데이터의 공유와 관리도 중요시되고 있다. 따라서 연구자들이 공동으로 데이터를 업데이트하거나 다운로드할 수 있는 데이터베이스와 대규모의 용량을 분석할 수 있는 서버, 그리고 서버에서 분석한 결과를 개별 컴퓨터에서 확인할 수 있는 시스템의 유기적인 관계가 요구된다. 하지만 생물데이터의 형식과 이를 분석하는 프로그램의 종류가 다양하므로 데이터의 공유와 관리, 그리고 분석 프로그램의 연계가 상당히 복잡하다.

 대다수의 생물학자들이 윈도우 운영체제의 컴퓨터를 사용하고 있으며 Vector NTI, DNA Star와 같은 생물데이터를 분석하는 상용화 프로그램을 많이 이용하고 있다. 하지만 이런 상용화 소프트웨어는 윈도우에서만 사용가능하며, 분석하는 데이터의 용량 및 길이에 제한을 두고있으므로, 대규모의 데이터를 분석하는 것은 적절하지 않다.

 CLC bio사에서는 대규모의 NGS 데이터 및 대규모의 데이터를 서버에서 분석할 수 있는 CLC Genomics Server(그림 11)와 데스크탑 컴퓨터에서 결과를 확인하고 Vector NTI, DNA Star와 같은 다양한 분석 프로그램에서 나온 결과 데이터를 사용할 수 있는 CLC Genomics Workbench를 개발하였다.

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그림 11. Genomics Server 시스템 아키텍처

 CLC Genomics Workbench에서 CLC Genomics Server에 NGS 데이터 및 대규모 분석 데이터를 업데이트하고 분석을 수행한 뒤 CLC Genomic Server에서 분석되어진 결과를 CLC Genomics Workbench에서 확인할 수 있는 플러그인이 있다. 이를 활용하면 대규모 리소스를 필요로 하는 데이터의 분석과 데스크탑 컴퓨터에서 가능한 데이터 분석을 구분하여 연구 업무의 효율성을 증대시킬 수 있다. 또한 윈도우, 리눅스, 매킨토시 등 운영체제에 관계없이 설치가 가능하기 때문에 다양한 운영체제에서 데이터를 분석하는 연구자들이 분석결과를 공유할 수 있다. 대부분의 상용화 프로그램은 연구자들이 원하는 분석 알고리즘이 없을 경우 이후 버전의 업그레이드 내용을 기다리거나, 다른 프로그램을 이용하여 분석할 수밖에 없으므로 분석의 일관성을 유지하기 어렵고, 번거로움이 가증되었다.

 하지만, CLC Genomics Server에서는 External Application 플러그인을 적용하여 CLC Genomics Workbench에 설치되어 있지 않는 알고리즘 및 분석법을 커맨드라인 방식으로 설치한 후 간단한 설정을 통해 별도의 인터페이스를 만들지 않더라도 CLC Genomics Workbench에서 데이터의 입력과 출력을 수행할 수 있으며, 분석 결과를 다른 분석에 응용할 수 있다.

 그림 12는 CLC Genomics Server에서 external application 모듈을 설정하는 것을 보이고 있으며, 그림 13은 external application을 통해서 구축한 새로운 모듈을 이용하여 분석하는 화면을 보이고 있다. 이와 같이 서버급에서 분석할 수 있는 시스템과 데스크탑 컴퓨터에서 분석할 수 있는 프로그램의 연계를 통해서 생물학자들이 복잡하고 다양한 데이터를 분석하는데 많은 도움을 줄 수 있을 것이다.

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그림 12. External Application of CLC Genomics Server. 자주 사용되는 커맨드라인 방식의 프로그램은 CLC Genomics Server의 External Application 설정을 통해 별도의 인터페이스를 만들지 않고 CLC Genomics Workbench에서 수행할 수 있다. 이를 이용하여 사용자에 맞춰진 workbench로 재구성할 수 있다.

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그림 13. CLC Genomics Workbench 플러그인 적용. External application 플러그인으로 구축된 새로운 모듈은 CLC Genomics Workbench에서 분석이 가능하다.






저희 (주)인실리코젠 Codes팀은 최신 생물정보학관련 연구 동향에 대한 기술 소식지(Quipu Issue Paper)를 발간하고 이 소식지를 통하여 빠르게 발전하는 NGS 시대에 다양한 변화를 습득하고 하시는 연구에 조금이나마 도움이 되길 바라면서 지난 2월부터 약 2개월에 걸쳐 저희 회사 블로그 Quipu(http://www.insilicogen.com/blog/)를 통해 연재를 진행하였습니다. 지난 2개월 동안 최신 생물정보학관련 연구 동향에 대한 기술 소식지 블로그 연재에 많은 관심 가져주셔서 진심으로 감사드리며 저희 (주)인실리코젠은 앞으로도 생물정보 분야에서 끊임없이 노력하는 기업이 되겠습니다.


(주)인실리코젠 Codes팀 배상
Tel: 031-278-0061 / E-mail: codes@insilicogen.com



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2010/04/09 09:42 2010/04/09 09:42

연재 순서

   1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis

이번 연재에서는 Next Generation Sequencing의 두 번째 Application인 Expression study 중에 유전자와 엑손의 발현 및 발현된 유전자의 각종 변이 등을 한 번에 연구할 수 있는 RNA-Seq 분석에 대해 알아보겠습니다.

2-2-6. RNA-Seq Analysis


 Serial Analysis of gene Expression(SAGE), Cap Analysis of gene expression (CAGE), 그리고 Massively Parallel Signature sequencing(MPSS)은 특정 유전자의 발현 양 정보를 얻고자 하는 목표로 수행되는 방법들이다. 이러한 방법들은 많이 이용되고 있지만 Sanger 방법에 바탕을 둔 것으로 높은 비용과 짧은 reads는 reference 서열에 유일하게 매핑하기 힘들다는 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제점들을 극복하기 위한 방법으로는 유전자와 엑손의 발현 및 발현된 유전자의 각종 변이 등을 한 번에 연구할 수 있는 RNA-Seq기술이 있다[1].

표 1에서 보는 것과 같이 RNA-Seq을 분석 할 수 있는 프로그램에는 여러 가지 소프트웨어가 있는데 그 중에 CLC Genomics Workbench는 annotation된 Reference 유전체 서열과 mRNA 시퀀싱 reads를 바탕으로 새로운 엑손의 발굴뿐만 아니라 유전자 발현 레벨을 계산할 수 있다. RNA-Seq 분석은 몇 가지 단계로 수행된다. 먼저, Reference 서열에서 모든 유전자를 추출한다. 이 때 유전자 서열의 다른 annotation들은 보존된다[23].

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다음으로 영역 주변의 엑손-엑손 경계를 추출한다. 그 다음으로 모든 엑손-엑손 junctions plus에 대한 Reference assembly가 수행된다. 이 assembly로부터 각각의 유전자에 대해 발현 수치가 계산되고 putative exon을 확인할 수 있다. 발현 수치는 RPKM(reads per kilobase of exon model per milion mapped reads)방법으로 측정된다(그림 9).

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그림 9. RNA_seq analysis.
(a) exon-exon junction+gene 서열을 reference 서열로 한다.
(b) NGS reads의 reference assembly를 통한 alignment를 통해
새로운 각 엑손 단위 혹은 유전자 단위의 발현양을 확인한다.


다음 연재에서는 한정적인 유전자를 좀 더 다양하게 활용할 수 있는 Alternative splicing 분석에 대해 알아보겠습니다. 많은 관심 부탁드립니다.


참고문헌


1. Mortazavi A, Williams BA, McCue K, Schaeffer L, Wold B. (2008) Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 7, 621-628.
2. Fei Z, Tang X, Alba RM, White JA, Ronning CM, Martin GB, Tanksley SD, Giovannoni JJ. (2004) Comprehensive EST analysis of tomato and comparative genomics of fruit ripening. Plant J. 40, 47–59
3. Rensink WA, Lee Y, Liu J, Iobst S, Ouyang S, Buell CR. (2005) Comparative analyses of six solanaceous transcriptomes reveal a high degree of sequence conservation and species-specific transcripts. BMC Genomics. 6, 124
4. Ronning,C.M. et al. (2003) Comparative analyses of potato expressed sequence tag libraries. Plant Physiol. 131, 419–429
5. Guo J, Zhu P, Wu C, Yu L, Zhao S, Gu X. (2003) In silico analysis indicates a similar gene expression pattern between human brain and testis. Cytogenet Genome Res. 103, 58-62
6. Benjamini, Y., Daniel Yekutieli. (2001) The control of the false discovery rate in multiple hypotheses testing under dependency. Annal. Stat. 4(29), 1165–1188
7. Tsai CA, Hsueh HM, Chen JJ. (2003) Estimation of false discovery rates in multiple testing: application to gene microarray data. Biometrics. 59, 1071-81
8. Audic S, Claverie JM. (1997) The significance of digital gene expression profiles. Genome Res. 7, 986–995
9. Roche 454 : Products & Solutions - Multiplexing
(http://www.454.com/products-solutions/experimental-design-options/multiplexing.asp)
10. Tatusov RL, Koonin EV, Lipman DJ. (1997) A genomic perspective on protein families. Science. 278, 631-637
11. Kato T, Murata Y, Miura K, Asai K, Horton PB, Koji T, Fujibuchi W. (2006) Network-based de-noising improves prediction from microarray data, BMC Bioinformatics. 7, S4
12. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 5, 229-243
13. Zeeberg BR, Feng W, Wang G, Wang MD, Fojo AT, Sunshine M, Narasimhan S, Kane DW, Reinhold WC, Lababidi S, Bussey KJ, Riss J, Barrett JC, Weinstein JN. (2003) GoMiner: a resource for biological interpretation of genomic and proteomic data, Genome Biol. 4, R28
14. GeneSpring GX : Products & Services - GeneSpring GX Software
(http://www.chem.agilent.com/en-US/products/software/lifesciencesinformatics/genespringgx/pages/default.aspx)
15. Wingender E, Chen X, Hehl R, Karas H, Liebich I, Matys V, Meinhardt T, Prüss M, Reuter I, Schacherer F. (2000) TRANSFAC: an integrated system for gene expression regulation. Nucleic Acids Research. 28, 316-319
16. PathwayStudio : Products-pathway Studio
(http://www.ariadnegenomics.com/products/pathwaystudio/)
17. Eveland AL, McCarty DR, Koch KE. (2007) Transcript profiling by 3'-untranslated region sequencing resolves expression of gene families. Plant Physiol. 146, 32-44.
18. Torres TT, Metta M, Ottenwälder B, Schlötterer C. (2008) Gene expression profiling by massively parallel sequencing. Genome Res. 1, 172-7.
19. Vega-Arreguín JC, Ibarra-Laclette E, Jiménez-Moraila B, Martínez O, Vielle-Calzada JP, Herrera-Estrella L, Herrera-Estrella A. (2009) Deep sampling of the Palomero maize transcriptome by a high throughput strategy of pyrosequencing. BMC Genomics. 10, 299.
20. Wang ET, Sandberg R, Luo S, Khrebtukova I, Zhang L, Mayr C, Kingsmore SF, Schroth GP, Burge CB. (2008) Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 2456, 70-76.
21. Johnson JM, Castle J, Garrett-Engele P, Kan Z, Loerch PM, Armour CD, Santos R, Schadt EE, Stoughton R, Shoemaker DD. (2003) Genome-wide survey of human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays. Science. 302, 2141-2144.
22. Ledford H. (2008) Human genes are multitaskers. Nature. 456, 9.
23. CLC Genomics Workbench: RNA-Seq analysis
(http://www.clcbio.com/index.php?id=1330&manual=RNA_Seq_analysis.html)

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2010/03/04 08:59 2010/03/04 08:59
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