연재 순서

   1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis

이번 연재에서는 Next Generation Sequencing의 두 번째 Application인 Expression study 중에 Digital Expression Profile(DEP)를 활용한 Expression pattern 분석Tissue Specific Gene 분석에 대해 알아보겠습니다.


2-2-2. Expression Pattern Analysis


 DEP를 활용하여 마이크로어레이 분석과 동일하게 다양한 조건에서의 유전자 발현을 분석한다. Fold change를 이용한 DEG 산출 및 hierarchical clustering, self-organizing maps, K-means clustering, PCA(Principle component analysis) 분석을 통해 의미 있는 발현 패턴들을 정교하게 표현하기도 하고, 이들 패턴들 간의 관계를 분석하기도 한다.
그림 4에서 보여 지는 것과 같이 모든 조직에서 일정한 비율로 발현되는 유전자는 house- keeping 유전자의 후보가 될 수 있으며, 유독 특정 조직에서만 발현되는 유전자들도 관찰 할 수 있다[2].

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그림 4. DEP를 활용한 유전자 발현 패턴 분석. 
Hierarchical clustering을 수행하여 동일한
패턴을 보이는 유전자들끼리 클러스터링 수행

조직뿐만 아니라 약물에 대한 반응성 실험을 수행 할 경우에도 time-series 라이브러리를 제작하고 여러 샘플을 한 번에 시퀀싱 할 수 있는 Multiplex Identifiers(MIDs)를 이용하여 단 시간에 많은 데이터로 이 같은 분석을 진행할 수 있다. Roche 454의 경우 192에서 최대 2300 개의 샘플을 한 번에 로딩하여 시퀀싱이 가능할 정도로 유연성이 있으므로 다양한 조건을 대상으로 분석에 활용할 수 있는 이점이 있다[9].

 이러한 발현 분석은 종전의 마이크로어레이 분석 프로그램으로 분석이 가능하다. 대표적인 예로 Agilent사의 GeneSpring GX을 들 수 있다[14]. 기본적인 통계학적 분석으로 ANOVA 분석, multiple testing corrections, FDR prediction 그리고 Tukey and Student-Newman-Keuls post hoc test 가 가능하며, 그래픽 데이터 표현으로는 2D/3D scatter plots, 2D dendrograms, 염색체 지도, pathway 다이어그램, 그리고 분류별 보기 기능으로 다양하게 표현이 가능하다.

사용자 삽입 이미지
그림 5. GeneSpring GX.
유전자 발현데이터 분석 프로그램으로 다양한 통계 분석과 가시화 프로그램이 수행된다.


발현 패턴 분석으로는 gene trees, experiment trees, self-organizing maps, K-means clustering, QT clustering, 그리고 PCA 분석이 가능한 것으로 알려져 있다. 이 모든 기능은 데스크탑 컴퓨터에서 분석이 가능하며, 사용자 편의성이 강조된 인터페이스로 구성되어 있어, 비전문가도 쉽게 분석을 수행할 수 있다.

2-2-3. Tissue Specific Gene Analysis


 조직 특이 유전자는 특정 조직에서 그 유전자의 세포내 평균 발현 양 보다 특이적으로 높게 발현 되어 특정 조직의 성격을 결정지을 수 있는 유전자를 선별하는 것을 목적으로 한다.
따라서 NGS reads를 이용하여 분석하고자 할 때에는 조직별 라이브러리 제작 시 아무런
영향을 주지 않은 정상적인 발현 상태의 라이브러리를 제작해야하며, normalization이나 subtraction과 같은 인위적인 선출 방식의 시퀀싱이 아닌 무작위적인 방식의 시퀀싱이 진행되어야만 한다. 무작위 적으로 일어나는 사건에 대한 확률 값을 계산하므로 포아송 분포(poisson distribution)를 이용한 Audic’s test를 통해 조직 특이 유전자를 선별한다[8]. 다음은 Audic’s test를 이용한 확률 값을 구하는 수식이다.

사용자 삽입 이미지
  이 때, 다양한 cutoff 파라미터를 통해 확률적으로 유의한 유전자를 선별하는데, p_value, enrichment, frequency 그리고 클러스터내의 minimum reads count 등을 이용 할 수 있다. 이중 p_value는 유의 수준을 나타내는 것으로 0.001의 cutoff는 유의 수준 99.9%를 의미하게 된다. 그러나 조직 특이 유전자 선별을 위해 한 두 개의 유전자를 대상으로 연관성 분석이 진행 되는 것이 아니라 앞서 언급된 파라미터를 통과한 모든 클러스터를 대상으로 연관성 분석이 진행하므로 검사의 개수가 증가할수록 임의로 발생하는 오류 또한 증가하여 p_value의 의미가 감소하는 문제점이 발생하게 된다. 이를 극복하기 위해 Bonferroni correction, False Discovery Rate(FDR), 그리고 Permutation test와 같은 다중 검정을 수행하게 된다[6, 7].

실제 분석을 위해 앞서 작성한 Cluster Member Matrix(CMM; DEP작성시 초기 matrix)를 이용하여 각 클러스터별로 x, y, N1, N2을 지정하여 계산할 수 있다[16]. 예를 들어 그림 3의 표에서 클러스터 1의 유전자가 ‘OC’ 조직에 특이적인 발현 양을 보이는지를 검사 한다고 했을 때 대상 조직의 reads 개수인 y 는 ‘10’이 되고 그 외 나머지 조직에 해당하는 reads 개수인 x 는 ‘82’가 된다. 그리고 N2, N1 은 각각 해당 조직 전체 reads 개수와 나머지 조직의 전체 reads 개수인 ‘55,840’과 ‘184,301’에 해당한다. 이러한 분석은 하나의 클러스터마다 검사해야할 조직 개수만큼 수행된다.


이번주에 이어서 다음 주에 진행될 연재에서도 Expression study의 다양한 분석 방법에 대해 연재가 될 예정입니다. 많은 관심 부탁드립니다. 


참고문헌

1. Mortazavi A, Williams BA, McCue K, Schaeffer L, Wold B. (2008) Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 7, 621-628.
2. Fei Z, Tang X, Alba RM, White JA, Ronning CM, Martin GB, Tanksley SD, Giovannoni JJ. (2004) Comprehensive EST analysis of tomato and comparative genomics of fruit ripening. Plant J. 40, 47–59
3. Rensink WA, Lee Y, Liu J, Iobst S, Ouyang S, Buell CR. (2005) Comparative analyses of six solanaceous transcriptomes reveal a high degree of sequence conservation and species-specific transcripts. BMC Genomics. 6, 124
4. Ronning,C.M. et al. (2003) Comparative analyses of potato expressed sequence tag libraries. Plant Physiol. 131, 419–429
5. Guo J, Zhu P, Wu C, Yu L, Zhao S, Gu X. (2003) In silico analysis indicates a similar gene expression pattern between human brain and testis. Cytogenet Genome Res. 103, 58-62
6. Benjamini, Y., Daniel Yekutieli. (2001) The control of the false discovery rate in multiple hypotheses testing under dependency. Annal. Stat. 4(29), 1165–1188
7. Tsai CA, Hsueh HM, Chen JJ. (2003) Estimation of false discovery rates in multiple testing: application to gene microarray data. Biometrics. 59, 1071-81
8. Audic S, Claverie JM. (1997) The significance of digital gene expression profiles. Genome Res. 7, 986–995
9. Roche 454 : Products & Solutions - Multiplexing
(http://www.454.com/products-solutions/experimental-design-options/multiplexing.asp)
10. Tatusov RL, Koonin EV, Lipman DJ. (1997) A genomic perspective on protein families. Science. 278, 631-637
11. Kato T, Murata Y, Miura K, Asai K, Horton PB, Koji T, Fujibuchi W. (2006) Network-based de-noising improves prediction from microarray data, BMC Bioinformatics. 7, S4
12. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 5, 229-243
13. Zeeberg BR, Feng W, Wang G, Wang MD, Fojo AT, Sunshine M, Narasimhan S, Kane DW, Reinhold WC, Lababidi S, Bussey KJ, Riss J, Barrett JC, Weinstein JN. (2003) GoMiner: a resource for biological interpretation of genomic and proteomic data, Genome Biol. 4, R28
14. GeneSpring GX : Products & Services - GeneSpring GX Software
(http://www.chem.agilent.com/en-US/products/software/lifesciencesinformatics/genespringgx/pages/default.aspx)
15. Wingender E, Chen X, Hehl R, Karas H, Liebich I, Matys V, Meinhardt T, Prüss M, Reuter I, Schacherer F. (2000) TRANSFAC: an integrated system for gene expression regulation. Nucleic Acids Research. 28, 316-319
16. PathwayStudio : Products-pathway Studio
(http://www.ariadnegenomics.com/products/pathwaystudio/)
17. Eveland AL, McCarty DR, Koch KE. (2007) Transcript profiling by 3'-untranslated region sequencing resolves expression of gene families. Plant Physiol. 146, 32-44.
18. Torres TT, Metta M, Ottenwälder B, Schlötterer C. (2008) Gene expression profiling by massively parallel sequencing. Genome Res. 1, 172-7.
19. Vega-Arreguín JC, Ibarra-Laclette E, Jiménez-Moraila B, Martínez O, Vielle-Calzada JP, Herrera-Estrella L, Herrera-Estrella A. (2009) Deep sampling of the Palomero maize transcriptome by a high throughput strategy of pyrosequencing. BMC Genomics. 10, 299.
20. Wang ET, Sandberg R, Luo S, Khrebtukova I, Zhang L, Mayr C, Kingsmore SF, Schroth GP, Burge CB. (2008) Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 2456, 70-76.
21. Johnson JM, Castle J, Garrett-Engele P, Kan Z, Loerch PM, Armour CD, Santos R, Schadt EE, Stoughton R, Shoemaker DD. (2003) Genome-wide survey of human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays. Science. 302, 2141-2144.
22. Ledford H. (2008) Human genes are multitaskers. Nature. 456, 9.
23. CLC Genomics Workbench: RNA-Seq analysis
(http://www.clcbio.com/index.php?id=1330&manual=RNA_Seq_analysis.html)

Posted by 人Co

2010/02/25 09:24 2010/02/25 09:24

연재 순서

   1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis

이번 연재에서는 Next Generation Sequencing의 두 번째 Application인 Expression study 중에 Digital Expression Profile(DEP) 작성하는 방법에 대해 알아보도록 하겠습니다.

2-2-1. Digital Expression Profile (DEP)


 동일한 유전자로 부터 발현된 mRNA의 양은 중복된 NGS reads의 개수를 계산함으로써 알 수 있다. 따라서 클러스터링 과정을 통해 중복된 reads를 동일 유전자에서 유래한 하나의 서열로 만들 수 있고 이렇게 형성된 unigene의 reads count profile은 결국 mRNA의 expression profile과 동일시 볼 수 있다[3]. 여러 조직에서 다양한 발현 양을 보이는 유전자의 경우 각 조직마다의 발현양은 시퀀싱된 reads 개수를 계산하는 방법으로 Digital Expression Profile(DEP)의 초기 데이터인 Cluster member matrix를 만들 수 있다(그림 2)[10, 17]. 앞서 언급한 마이크로어레이 분석에서도 Intensity value를 실제 분석에 앞서 다양한 정규화과정(Normalization)을 수행하는 것과 같이 DEP에서도 두 단계의 정규화과정을 통해 최종적인 DEP를 완성한다[2].

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그림 2. Cluster Member Matrix(CMM).
Clustering을 통한 유전자 발현 counting. De novo assembly를 통해
각 cluster(consensus sequence) 마다의 NGS reads를 조직별로 counting 하여
Digital Expression Profile(DEP)의 초기데이터인 clutser member matix를 완성한다.

A. Library Normalization

 특정 라이브러리가 다른 라이브러리들에 비해 유독 많이 시퀀싱되어 reads의 양이 많다면, 클러스터링을 통해 얻어진 클러스터 내의 reads 또한 다른 라이브러리에 비해 많이 나타날 것이다. 이는 실제 세포내의 발현 양이라기보다는 데이터 세트 자체의 시퀀싱 개수가 많아서 생기는 것이므로 라이브러리별로 특정 유전자가 그 조직에서 얼마만큼의 발현이 이뤄졌는지를 비율을 통해 나타내야 한다. 따라서 특정 클러스터의 reads 개수에서 그 라이브러리 전체 reads 개수 만큼을 나눠주는 정규화방식이다.

B. Unigene Normalization

 Library normalization 수행으로 각 라이브러리에서의 발현 비율로 unigene의 발현 정도를 얻을 수 있다. 그러나 이때 house-keeping 유전자의 경우에 늘 많이 발현되는 유전자이므로 전체적으로 발현 비율이 높다. 반면 그렇지 않은 유전자의 경우 수치가 전체적으로 낮게 나타난다. 이럴 경우, 수치상의 차이가 너무 크기 때문에 라이브러리별 혹은 컨디션별로 유전자의 발현 패턴을 보고자 할 때 너무 높은 발현 수치로 인해 상대적으로 낮은 수치로 일정 패턴을 갖는 유전자는 그 의미가 퇴색되어진다. 이러한 점을 정규화 하기 위해 median value로 나눠주거나, log ratio 취하여 유전자간 수치적 차이를 최소화 하게 한다. Median value 정규화 과정은 그림 3에서 보는 것과 같이 각 클러스터(unigene) 별로 1차 library 정규화 결과 값들을 대상으로 그 중간 값인 0.000341853(media value)로 나눠준다. 그러면 중간 정도의 발현 값을 보이는 라이브러리인 ‘ZG’ 에서는 값이 ‘1’이 나오고 되고, 세포내 전체적인 평균 발현 보다 높은 발현은 ‘1’보다 높은 수치로 정렬되며, ‘1’ 이하는 낮은 발현을 나타내게 된다. 이렇게 두 단계의 정규화 수행 후 최종적인 DEP를 완성하게 된다.

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그림 3. Digital Expression Profile (DEP).
Cluster Member Matrix(CMM)을 바탕으로 두 단계의
normalization 과정을 통해 표준화된 expression value로 환산 된다.


이렇게 완성된 DEP는 다양한 발현 패턴 분석에서부터 조직 특이 유전자 그리고 Ortholog 분석에도 이용된다.

다음 연재에서는 Expression study 중에 Digital Expression Profile(DEP)를 활용한 Expression pattern 분석에 대해 알아보도록 하겠습니다.

많은 관심 부탁드립니다.


참고문헌

1. Mortazavi A, Williams BA, McCue K, Schaeffer L, Wold B. (2008) Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 7, 621-628.
2. Fei Z, Tang X, Alba RM, White JA, Ronning CM, Martin GB, Tanksley SD, Giovannoni JJ. (2004) Comprehensive EST analysis of tomato and comparative genomics of fruit ripening. Plant J. 40, 47–59
3. Rensink WA, Lee Y, Liu J, Iobst S, Ouyang S, Buell CR. (2005) Comparative analyses of six solanaceous transcriptomes reveal a high degree of sequence conservation and species-specific transcripts. BMC Genomics. 6, 124
4. Ronning,C.M. et al. (2003) Comparative analyses of potato expressed sequence tag libraries. Plant Physiol. 131, 419–429
5. Guo J, Zhu P, Wu C, Yu L, Zhao S, Gu X. (2003) In silico analysis indicates a similar gene expression pattern between human brain and testis. Cytogenet Genome Res. 103, 58-62
6. Benjamini, Y., Daniel Yekutieli. (2001) The control of the false discovery rate in multiple hypotheses testing under dependency. Annal. Stat. 4(29), 1165–1188
7. Tsai CA, Hsueh HM, Chen JJ. (2003) Estimation of false discovery rates in multiple testing: application to gene microarray data. Biometrics. 59, 1071-81
8. Audic S, Claverie JM. (1997) The significance of digital gene expression profiles. Genome Res. 7, 986–995
9. Roche 454 : Products & Solutions - Multiplexing
(http://www.454.com/products-solutions/experimental-design-options/multiplexing.asp)
10. Tatusov RL, Koonin EV, Lipman DJ. (1997) A genomic perspective on protein families. Science. 278, 631-637
11. Kato T, Murata Y, Miura K, Asai K, Horton PB, Koji T, Fujibuchi W. (2006) Network-based de-noising improves prediction from microarray data, BMC Bioinformatics. 7, S4
12. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 5, 229-243
13. Zeeberg BR, Feng W, Wang G, Wang MD, Fojo AT, Sunshine M, Narasimhan S, Kane DW, Reinhold WC, Lababidi S, Bussey KJ, Riss J, Barrett JC, Weinstein JN. (2003) GoMiner: a resource for biological interpretation of genomic and proteomic data, Genome Biol. 4, R28
14. GeneSpring GX : Products & Services - GeneSpring GX Software
(http://www.chem.agilent.com/en-US/products/software/lifesciencesinformatics/genespringgx/pages/default.aspx)
15. Wingender E, Chen X, Hehl R, Karas H, Liebich I, Matys V, Meinhardt T, Prüss M, Reuter I, Schacherer F. (2000) TRANSFAC: an integrated system for gene expression regulation. Nucleic Acids Research. 28, 316-319
16. PathwayStudio : Products-pathway Studio
(http://www.ariadnegenomics.com/products/pathwaystudio/)
17. Eveland AL, McCarty DR, Koch KE. (2007) Transcript profiling by 3'-untranslated region sequencing resolves expression of gene families. Plant Physiol. 146, 32-44.
18. Torres TT, Metta M, Ottenwälder B, Schlötterer C. (2008) Gene expression profiling by massively parallel sequencing. Genome Res. 1, 172-7.
19. Vega-Arreguín JC, Ibarra-Laclette E, Jiménez-Moraila B, Martínez O, Vielle-Calzada JP, Herrera-Estrella L, Herrera-Estrella A. (2009) Deep sampling of the Palomero maize transcriptome by a high throughput strategy of pyrosequencing. BMC Genomics. 10, 299.
20. Wang ET, Sandberg R, Luo S, Khrebtukova I, Zhang L, Mayr C, Kingsmore SF, Schroth GP, Burge CB. (2008) Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 2456, 70-76.
21. Johnson JM, Castle J, Garrett-Engele P, Kan Z, Loerch PM, Armour CD, Santos R, Schadt EE, Stoughton R, Shoemaker DD. (2003) Genome-wide survey of human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays. Science. 302, 2141-2144.
22. Ledford H. (2008) Human genes are multitaskers. Nature. 456, 9.
23. CLC Genomics Workbench: RNA-Seq analysis
(http://www.clcbio.com/index.php?id=1330&manual=RNA_Seq_analysis.html)


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2010/02/23 09:50 2010/02/23 09:50

[Quipu Issue Paper] Expression Study Ⅰ

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   1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
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   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis

이번주부터 2주간 진행되는 연재에서는 Next Generation Sequencing의 두 번째 Application인 Expression study에 대해 알아보도록 하겠습니다.


2-2. Expression Study

 

 Functional genomics의 유전자 발현 연구 분야에도 NGS는 예외 없이 새로운 방향을 제시하면서 transcriptome 분야를 포함하여 많은 부분에서 PCR이나 마이크로어레이 기술을 대체 하고 있다. 이러한 NGS 기술은 분석 할 종의 서열 정보가 없어도 분석 가능하여 어떤 생물종도 연구에 이용할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 뿐만 아니라 한 번의 시퀀싱으로 수많은 read를 얻는 높은 coverage를 가지기 때문에 단 시간에 적은 비용으로 전체 염기서열을 결정할 수 있는 이점이 있다. 이러한 장점들은 마이크로어레이를 이용한 종전의 분석법에서 나타난 여러 문제점을 보완하면서 다양한 방향으로 연구를 수행할 수 있게 하였다. Development stage, stress, tissue와 같이 특정 컨디션에서의 유전자 발현 양상을 보는 것에서부터 조직 특이 유전자 분석, house keeping 유전자 분석, 유전자 발현을 이용한 ortholog 분석, SNP 분석 그리고 alternative splicing 분석에 이르기까지 다양한 분야에 걸쳐 분석이 가능하게 되었다[1].

발현 분석은 언제, 어디서, 어느 정도로 유전자들이 발현되는 지를 전사 수준에서 총체적으로 탐색 하는 것을 목적으로 한다. 따라서 원하는 컨디션이 반영된 mRNA를 추출하여 라이브러리를 제작하게 되고, 무작위 적으로 시퀀싱 하여 얻어진 서열을 클러스터링을 통해 발현 양을 추정하게 된다[2, 4, 5, 17, 18, 19].


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그림 1. 유전자 발현 패턴 분석.
전사 수준에서의 발현 패턴 분석을 위해 mRNA sequencing을 통해
세포내 유사한 발현 패턴을 보이는 유전자들을 분석


 이러한 방법은 기존의 ESTs를 활용한 발현 분석과 동일한 방법으로, 클러스터링 방법 또한 EST 클러스터링과 같이 유전체 서열이 존재하는 경우 references assembly을 수행하여 유전자 영역을 기준으로 클러스터링을 수행하게 되고, 만약 유전체 서열이 존재하지 않을 경우 de novo assembly을 수행 하게 된다. 단 de novo assembly의 경우 assembly의 정확성을 위해 short reads 보다는 Roche 454의 long reads를 이용하는 것이 보다 정확한 결과를 얻을 수 있다(1-2. Assembly 참조)[17, 18, 19].

 클러스터링이 완료되면 각 클러스터 별로 포함되어 있는 NGS reads의 개수를 발현 수치 값으로 환산하여 Digital Expression Profile(DEP)를 작성하게 되며 이는 마치 마이크로어레이의 intensity를 이용한 분석법과 같이 분석하게 된다[17, 18]. 이때, 실험적인 바이어스와 생물학적 컨디션을 고려한 다양한 통계적 방법이 이용된다.


다음 연재에서는 Expression study 중에 먼저 여러 조직에서 다양한 발형 양을 보이는 유전자의 경우 각 조직마다의 발현양을 계산하는 방법인 Digital Expression Profile(DEP) 작성하는 방법에 대해 알아보도록 하겠습니다.

많은 관심 부탁드립니다.


참고문헌

1. Mortazavi A, Williams BA, McCue K, Schaeffer L, Wold B. (2008) Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 7, 621-628.
2. Fei Z, Tang X, Alba RM, White JA, Ronning CM, Martin GB, Tanksley SD, Giovannoni JJ. (2004) Comprehensive EST analysis of tomato and comparative genomics of fruit ripening. Plant J. 40, 47–59
3. Rensink WA, Lee Y, Liu J, Iobst S, Ouyang S, Buell CR. (2005) Comparative analyses of six solanaceous transcriptomes reveal a high degree of sequence conservation and species-specific transcripts. BMC Genomics. 6, 124
4. Ronning,C.M. et al. (2003) Comparative analyses of potato expressed sequence tag libraries. Plant Physiol. 131, 419–429
5. Guo J, Zhu P, Wu C, Yu L, Zhao S, Gu X. (2003) In silico analysis indicates a similar gene expression pattern between human brain and testis. Cytogenet Genome Res. 103, 58-62
6. Benjamini, Y., Daniel Yekutieli. (2001) The control of the false discovery rate in multiple hypotheses testing under dependency. Annal. Stat. 4(29), 1165–1188
7. Tsai CA, Hsueh HM, Chen JJ. (2003) Estimation of false discovery rates in multiple testing: application to gene microarray data. Biometrics. 59, 1071-81
8. Audic S, Claverie JM. (1997) The significance of digital gene expression profiles. Genome Res. 7, 986–995
9. Roche 454 : Products & Solutions - Multiplexing
(http://www.454.com/products-solutions/experimental-design-options/multiplexing.asp)
10. Tatusov RL, Koonin EV, Lipman DJ. (1997) A genomic perspective on protein families. Science. 278, 631-637
11. Kato T, Murata Y, Miura K, Asai K, Horton PB, Koji T, Fujibuchi W. (2006) Network-based de-noising improves prediction from microarray data, BMC Bioinformatics. 7, S4
12. Noh SJ, Lee K, Paik H, Hur CG. (2006) TISA: tissue-specific alternative splicing in human and mouse genes. DNA Res. 5, 229-243
13. Zeeberg BR, Feng W, Wang G, Wang MD, Fojo AT, Sunshine M, Narasimhan S, Kane DW, Reinhold WC, Lababidi S, Bussey KJ, Riss J, Barrett JC, Weinstein JN. (2003) GoMiner: a resource for biological interpretation of genomic and proteomic data, Genome Biol. 4, R28
14. GeneSpring GX : Products & Services - GeneSpring GX Software
(http://www.chem.agilent.com/en-US/products/software/lifesciencesinformatics/genespringgx/pages/default.aspx)
15. Wingender E, Chen X, Hehl R, Karas H, Liebich I, Matys V, Meinhardt T, Prüss M, Reuter I, Schacherer F. (2000) TRANSFAC: an integrated system for gene expression regulation. Nucleic Acids Research. 28, 316-319
16. PathwayStudio : Products-pathway Studio
(http://www.ariadnegenomics.com/products/pathwaystudio/)
17. Eveland AL, McCarty DR, Koch KE. (2007) Transcript profiling by 3'-untranslated region sequencing resolves expression of gene families. Plant Physiol. 146, 32-44.
18. Torres TT, Metta M, Ottenwälder B, Schlötterer C. (2008) Gene expression profiling by massively parallel sequencing. Genome Res. 1, 172-7.
19. Vega-Arreguín JC, Ibarra-Laclette E, Jiménez-Moraila B, Martínez O, Vielle-Calzada JP, Herrera-Estrella L, Herrera-Estrella A. (2009) Deep sampling of the Palomero maize transcriptome by a high throughput strategy of pyrosequencing. BMC Genomics. 10, 299.
20. Wang ET, Sandberg R, Luo S, Khrebtukova I, Zhang L, Mayr C, Kingsmore SF, Schroth GP, Burge CB. (2008) Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 2456, 70-76.
21. Johnson JM, Castle J, Garrett-Engele P, Kan Z, Loerch PM, Armour CD, Santos R, Schadt EE, Stoughton R, Shoemaker DD. (2003) Genome-wide survey of human alternative pre-mRNA splicing with exon junction microarrays. Science. 302, 2141-2144.
22. Ledford H. (2008) Human genes are multitaskers. Nature. 456, 9.
23. CLC Genomics Workbench: RNA-Seq analysis
(http://www.clcbio.com/index.php?id=1330&manual=RNA_Seq_analysis.html)




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2010/02/22 13:46 2010/02/22 13:46

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   1. Assembly
   2. Variation study
   3. Expression study
   4. Epigenomics
   5. Genome Annotation
   6. Next Generation Bioinformatics
   7. Data Management for web 2.0 Era
   8. Semantic Network for Integrated Biology Data
   9. Gene Network Discovery by Text-mining
  10. Centralization for High-throughput Data Analysis


이번 연재에서는 Next Generation Sequencing의 첫 번째 Application인 Variation study 중에 CNV (Copy Number Variation) 분석법에 대해 알아보도록 하겠습니다.

 2-1-2. CNV (Copy Number Variation) Analysis                                    


 SNP가 유전적 다형성의 대명사로 여겨졌지만 이외에도 정상 표현형인 인간의 유전체에 유전자 복제 수(copy number) 변이가 존재하여 유전적 다양성에 기여하고, 암 또는 많은 질병 감수성과도 연관될 가능성이 높다는 연구 결과가 보고되면서 유전체의 구조적 변이에 대한 관심이 대두되었다. CNV(Copy Number Variants)는 reference 유전체와 비교해서 copy number의 차이를 보이는 1kb 이상의 DNA 조각으로 정의하며, 평균 크기는 29kb에서 523kb 정도로 예상된다고 한다.

현재 전체 유전체에서 CNV를 발굴하는 방식 중 가장 흔히 사용되는 방식은 CGH (comparative genomic hybridization)의 원리에 DNA 칩의 기술을 접목시킨 array-CGH이다. 마이크로어레이 기반 CGH 실험 분석 목적은 모든 유전체 안에서 각각의 유전자 조각들이 반복 횟수 변화를 보이는 부분을 선별해 내거나 반복 횟수의 양적 변화를 찾는 것이다. 이렇게 마이크로어레이 플랫폼을 이용해 발굴된 CNV는 분석에 이용된 플랫폼 의존 특성을 가지게 되어 최종 데이터의 질적인 측면과 연관되어 분석 결과의 치우침 문제를 유발할 수 있다. 또한 hybridization 효율이 프로브 마다 다양하고, 실제 copy number의 프로브 서열이 아닐 가능성도 고려해야 하는 한계에 봉착하였다. 이에 이를 극복할 만한 대안이 필요한 상황에서 NGS 기술의 보급은 CNV 발굴의 차세대 플랫폼으로 등장하였다. 앞서 언급된 NGS 기술을 통한 SNP 분석과 마찬가지로 유전체 서열과 다양한 fragment size의 paired-end reads를 assembly 함으로써 시퀀싱 coverage를 이용한 잠재적인 CNV를 분석할 수 있다(그림 4).

사용자 삽입 이미지
그림 4. aCGH와 CNV-seq 방법의 분석 과정 비교


그러나 SNP와 같이 하나의 염기서열 차이로 변이를 확인하는 것이 아니기 때문에 assembly 분석 시 시퀀싱 오류로 인하여 다른 부분에 정렬되어 잘못된 variation을 검출하게 되는 가능성도 배제할 수는 없다. 따라서 최근 Robust 통계 모델을 기본으로 하면서 aCGH와 NGS 기술의 이점들만 조합하여 효율적인 CNV 분석에 대한 논문이 발표되었고 이러한 방법을 이용하여 두 개체(Dr. J. Craig Venter와 Dr. James Watson) 사이의 CNV를 분석한 평가 결과도 함께 확인할 수 있어 이 후 aCGH와 NGS 기술을 접목한 CNV 분석 방법이 충분히 발전할 것으로 생각된다[4]. 이렇게 진행한 연구 방법과 결과들은 웹사이트를 통하여 무료로 이용할 수 있다(http://tiger.dbs.nus.edu.sg/CNV-seq).

다음 연재에서는 전체 유전체의  염기서열 분석이 아닌 관심있는 특정 유전체의 일부분을 분석하는 방법인 Sequence Capture 기술에 대해 알아보도록 하겠습니다.
많은 관심 부탁드립니다.




참고문헌

 1. 이종극 (2006) 질병유전체분석법(Genetic Variation and Diseases)
 2. Eck SH, Benet-Pagès A, Flisikowski K, Meitinger T, Fries R, Strom TM. (2009) Whole genome sequencing of a single Bos taurus animal for single nucleotide polymorphism discovery. Genome Biol. 10(8), R82.
 3. Ganal MW, Altmann T, Röder MS. (2009) SNP identification in crop plants. Curr Opin Plant Biol. 2, 211-217
 4. Xie C, Tammi MT. (2009) CNV-seq, a new method to detect copy number variation using high-throughput sequencing. BMC Bioinformatics. 10, 80
 5. Illumina : SNP Genotyping and CNV Analysis
  (http://www.illumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_genomic_sequence.pdf)
 6. Bentley DR. et al. (2008) Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature. 2008 456, 53-59
 7. Ng SB. et al. (2009) Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes. Nature. 461, 272-276
 8. Koboldt DC, Miller RD, Kwok PY. (2006) Distribution of human SNPs and its effect on high-throughput genotyping. Hum Mutat. 3, 249-254.
 9. 박종화 (2009) 변이체학을 위한 생정보학 분석도구. Medical POSTGRADUATES. 3(37), 131-133
 10. 유향숙, 김선영 (2009) Variome 국제연구동향. Medical POSTGRADUATES. 3(37), 134-137
 11. 임선희, 정연준. (2009) 새로운 유전체 변이의 등장 : 유전자 복제수 변이. Medical POSTGRADUATES. 3(37), 149-153

Posted by 人Co

2010/02/18 09:17 2010/02/18 09:17
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